الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالبروتينات المميزة لأنشطة مماثلة لها أدوار مختلفة ، اعتمادًا على التعريب في المغلف ، أو الأغشية السترمية ، أو الأغشية الهيلاكويد. عموما، سوف الأفراد جديدة لهذه الطريقة النضال، لأنها سوف تستخدم النباتات التي هي قديمة جدا، ومزج ورقة لفترة طويلة جدا، أو لن تكون حذرا بما فيه الكفاية عند إعادة تعليق الكريات من البلاستيك السليمة، ولكن هشة، الكلوروبلاست. إن العرض التوضيحي المرئي لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية، حيث يصعب تعلم تحميل أو استرداد جزء من percoll أو في خطوات التدرج في السكروز.
بسبب خطر مزج التدرجات وبالتالي من التلوث عبر الكسور الفرعية للبلاستات المختلفة. سيكون إثبات الإجراء من قبل ايمن بوشناق، وهو طالب دكتوراه من مختبرنا ولوكاس مويت، مهندس داخلي. للبدء، تنمو النباتات arabidopsis لمدة خمسة أسابيع مع دورة ضوء 12 ساعة في 23 درجة مئوية في اليوم و 18 درجة مئوية في الليل، مع شدة خفيفة من 150 ميكرومولر لكل متر مربع في الثانية الواحدة.
في اليوم التالي، قبل وزن 5 لتر منقار ومن ثم وضعه على الجليد. حصاد الأوراق arabidopsis، والتأكد من تجنب قطف أي تربة. إعادة وزن القارق وتسجيل وزن الأنسجة.
نقل الأوراق المحصودة إلى غرفة باردة. ضع الأوراق في الخلاط الذي يحتوي على لترين من عازلة طحن والتجانس لهم عن طريق مزجها بسرعة عالية ثلاث مرات لمدة ثانيتين في كل مرة. مكان أربع طبقات من الموسلين وطبقة واحدة من تكس الأزرق النايلون في مصفاة وهذا لتصفية التجانس.
ضغط بلطف الأوراق المخلوطة داخل الموسلين والأزرق تكس لاستخراج كل من السائل. استعادة الأنسجة المتبقية في كوب الخلاط وتكرار عملية التجانس باستخدام عازلة طحن الطازجة. استخدم أربع إلى خمس طبقات من الموسلين الجديد لتصفية هذا المتجانس الجديد في القارص الجديدة كما هو موضح مسبقًا.
توزيع استخراج الخلية الخام بالتساوي في ستة زجاجات 500 ملليلتر. ضع الزجاجات على الثلج الطرد المركزي الزجاجات المبردة في 2070 G وأربع درجات مئوية لمدة دقيقتين.
بعد هذا، تجاهل بلطف المابير. استخدام مضخة المياه لpirate أي عظمى المتبقية والحفاظ على الكريات، التي تحتوي على الكلوروبلاست الخام المركزة، على الجليد. باستخدام ماصة 10 ملليلتر، إضافة ثلاثة ملليلتر من غسل المتوسطة لكل زجاجة، مع التأكد من عدم استخدام نصائح ماصة غرامة لتجنب كسر chloroplasts.
ثم، استخدم فرشاة الطلاء أو ملعقة بلاستيكية منحنية لإعادة تعليق الكريات بلطف. باستخدام ماصة 10 ملليلتر، وجمع البلاستومات الكلورية التي أعيد تعليقها في أنبوب واحد. عكس بلطف أنبوب للحصول على تعليق الكلورس متجانسة.
للبدء، استخدم ماصة 10 ملليلتر لتحميل ببطء ستة ملليلترات من تعليق البلاستيك الكلوري على رأس كل من ست تدرجات بيركول المعدة. باستخدام دوار دلو يتأرجح، الطرد المركزي التدرجات في 13، 300 G وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. استخدام مضخة المياه لpirate المرحلة العليا، والتي تحتوي على كلوربلاستيدات مكسورة والميتوكوندريا سليمة.
ثم، استخدام ماصة 10 ملليلتر لاسترداد البلاستيدات الكلورية سليمة موجودة في المرحلة السفلى، مع الحرص على عدم التعرق النوى ومخلفات الخلية وجدت في الجزء السفلي من الأنبوب جنبا إلى جنب مع chloroplasts سليمة. تمييع تعليق الكلوربلاست سليمة ثلاثة إلى أربعة أضعاف مع غسل المتوسطة. الاحتفاظ بحوالي 10 ملليلترات من aliquot من كسر الكلوروبلاست سليمة لمزيد من التحليل من قبل SDS-الصفحة والغربية النشاف.
جهاز طرد مركزي عند 2070 غ و4 درجات مئوية لمدة دقيقتين. بعد هذا، تجاهل بلطف المابير. استخدام مضخة المياه لpireate أي عظمى المتبقية والحفاظ على بيليه، الذي يحتوي على الكلوروبلاستس الخام المركزة، على الجليد.
لlyse chloroplasts سليمة النقية، إعادة تعليق بيليه في الوسط هابوتونيك التي تحتوي على مثبطات البروتياز. نقل عمليات البلاستيدات التي أعيد تعليقها إلى أنبوب صقر 10 ملليلتر. إعداد التدرج السكروز كما هو موضح في بروتوكول النص.
باستخدام مضخة التمهل، ببطء تحميل ثلاثة ملليلتر من chloroplasts lysed على رأس كل من التدرجات السكروز شكلت مسبقا. استخدام العازلة المتوسطة هابوtonic لموازنة أزواج من الأنابيب، ومن ثم فائقة الطرد المركزي التدرج في 70، 000 G وأربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. خذ aliquot من البروتينات السترومال القابلة للذوبان لاستخدامها في تحديد تركيز البروتين.
بعد ذلك، استخدم مضخة مياه لضخ الطور العلوي المتبقي من التدرج حتى الشريط الأصفر. باستخدام ماصة، استرداد الفرقة الصفراء، وهو المغلف. سحب المغلفات في أنبوب واحد.
ثم، إزالة المرحلة المتبقية من التدرج حتى بيليه thylakoid. إعادة تعليق الكريات ثيلاكويد في العازلة غسل الغشاء مع مثبطات البروتياز. تمييع تعليق ثيلاكويد والمغلف من ثلاثة إلى أربعة أضعاف مع غسل المتوسطة، وضبط حجم النهائي إلى 10 ملليلتر.
توازن أزواج من الأنابيب مع العازلة غسل الغشاء والطاردة المركزية فائقة لهم في 110، 000 G وأربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، استخدام مضخة المياه لpirate بعناية عظمى. إضافة ما يقرب من 100 ميكرولترات من العازلة غسل الغشاء إلى بيليه المغلف.
ثم، pirate الماكر من أنبوب ثيلاكويد. إعادة تعليق الكريات ثيلاكويد في ثلاثة ملليلتر من العازلة غسل الغشاء. قم بتخزين المقصورات الفرعية الثلاثة المنقاة في النيتروجين السائل لاستخدامها في المزيد من التجارب.
بعد أن يتم استرداد كسور الغشاء، وغسلها، وتركيزها، يتم استخدام SDS-Page لتحديد البروتينات وتحليل تكوين جميع الكسور الأربعة. البروتين الأكثر وفرة من ستروما هو RBCL، وتظهر النتائج التمثيلية النتيجة المتوقعة، أن القليل جدا من الوحدة الفرعية الكبيرة من هذا البروتين يتم احتواء thylakoid و كسور غشاء المغلف. البروتينات الخفيفة حصاد معقدة هي مكونات الثايلاكويد وفيرة التي ينبغي بالكاد تلوث أغشية المغلف.
وأخيراً، فإن مُنقَل الفوسفات الثلاثي الفوسفات لا يظهر إلا في جزء المغلف المنقى، بسبب الإثراء القوي في جزء الظرف بالمقارنة مع مستخلصات الكلوروبلاست الكاملة. التلوث المتقاطع للحجرات الفرعية الثلاثة، والذوبان كيتول حمض reductoisomerase من ستروما، وغلاط الكلوروبلاست النحاس ATPase، والبروتينات المعقدة الحصاد الخفيفة من الأغشية الثايلاكويد يمكن أن يكون كميا باستخدام كل من تحليل قياس المناعة وقياس الطيف الشامل. في حين أن ستروما ليست ملوثة عادة من قبل المغلف أو كسور ثيلاكويد، وكسور المغلف النقية تحتوي على 3٪ بروتينات ثيلاكويد وما يصل إلى 10٪ من البروتينات من ستروما.
وthylakoids سيئة الملوثة من البروتينات من ستروما، ولكن تحتوي على ما يصل إلى 3٪ من بروتينات غشاء المغلف. تقوم البلاستيدات الكلورية بالعديد من الوظائف الحاسمة مثل استيعاب الكربون والكبريت والنيتروجين، بالإضافة إلى تركيب الأيضات الأساسية. من أجل فك الآليات التنظيمية الجديدة التي تتحكم في فسيولوجيا البلاستيك الكلور، تحديد توطين سوربلاستي من بروتينات الكلوروبلاست أمر بالغ الأهمية للدراسات فائقة الاستهداف.
تحتوي البلاستيدات على عدة مقصورات فرعية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البلاستومات، مثل حيث يوجد بروتين كلوربلاست محدد داخل organelle. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن تجري جميع خطوات العزلة بالبلاستات في أربع درجات لتحويل مقاومة البروتي إلى كسور منقّاة.
بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل الأساليب البروتيومية لاسكير من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل تكوين وديناميات البروتيوم من القيم sub-compartments plastid. بعد تطورها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال فسيولوجيا النبات لاستكشاف العديد من الجوانب المختلفة للتجميد الحيوي للبلاست والوظيفة باستخدام تحليل مستهدف للبروتينات المرشحة المحددة داخل مقصورات فرعية من البلاستيك. لا ننسى أن العمل مع حجم الخلاط، النيتروجين السائل، على مركبات محددة مثل مثبطات البروتياز، يتطلب عناية خاصة.
الاحتياطات مثل ارتداء القفازات، ومعطف المختبر، ونظارات السلامة ينبغي دائما أن تتخذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
