يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التدخل العلاجي المثبط للمناعة لدراسة الآثار السلبية للأدوية على تجديد الأنسجة ، على وجه الخصوص ، في العظام. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يجمع بين النماذج السابقة لتجديد عظم حمار وحشي مع التعرض للمخدرات النظامية عن طريق غمر حمار وحشي مصاب في مياه السمك المكملة للمخدرات. قبل البدء في الإجراء، وأتمتة واحد رقائق الألومنيوم غطت 600 milliliter beaker لكل حمار وحشي وعدد مناسب من الزجاجات من مياه السمك للتجربة وإعداد الدواء المثبط للمناعة في حلول المكافحة التجريبية من الفائدة.
للإصابة ببتر، استخدم ملقط حادة لوضع بعناية حمار وحشي مُجَدَّد على جانبه الجانبي على غطاء معكوس من طبق بيتري عيار 100 ملليمتر واستخدم مشرطًا لإعادة 50٪ من الزعنفة. ثم ضع السمكة في منقار autoclaved يحتوي على 300 ملليلتر من ماء السمك تكمل مع وكيل تجريبي مناسب وتغطية الكدر مع احباط لمنع هروب حمار وحشي. للحث على إصابة كسر زعنفة، ضع حمار وحشي مُغدَّر على جانبه الجانبي في طبق بيتري مغلف من 100 ملليمتر تحت مجهر تشريح ودفع إبرة حقن قليلاً في جزء من أشعة الزعنفة العظمية حتى يظهر صدع.
من المهم إدخال كسور كثيرة في الزعنفة لأن هذا قد يضعف الاستقرار إلى حد كبير. ثم نقل الأسماك إلى القارض الذي يحتوي على 300 ملليلتر من ماء السمك تكملة مع العامل التجريبي المناسب. لتوليد إصابة الجمجمة الكالفاري، عقد حمار وحشي تخدير في وضع مستقيم بحيث يتم تصور عظام العجلية بسهولة تحت مجهر تشريح.
ضع مثقاب صغير دوار مجهز بت حفر 500 ميكرومتر فوق مركز العظم الأمامي والمس العظام بلطف لإنتاج ثقب في حجم حفر صغيرة. من المهم عدم تحريك الحفر بشكلٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍّيّ أثناء إنتاج الإصابة والتوقّف فورًا عند المقاومة التي تسقطها الأنسجة. وإلا، فإن الدماغ سوف يتلف.
ثم ضع السمكة في منقار ذاتي التكفا يحتوي على 300 ملليلتر من ماء السمك مع إضافة عامل التجارب المناسبة. تغيير المياه في القارور يوميا عن طريق نقل حمار وحشي ومياه السمك إلى حاوية مؤقتة مناسبة وإعادة ملء الكأس مع المخدرات الطازجة مكملة مياه السمك. ثم استخدام شبكة السمك لإعادة حمار وحشي إلى منقارها.
للعلاجات التي تستمر لمدة تصل إلى يومين، لا تطعم حمار وحشي. خلال التجارب الطويلة، قم بإطعام سمك الحمار الوحشي بـ 0.5 إلى ملليلتر واحد من ARTEmia SSP المفقوس كل يومين. لتحليل إصابات الزعنفة، حصاد الغرامة واستخدام ملقط غرامة لفهم زعنفة في حافة واحدة من جذع.
استخدام زوج الثاني من ملقط للاستيلاء على حافة جذع المعاكس واضغط قليلا على الأنسجة على الجزء السفلي من الطبق الذي يحتوي على البارد 4٪ PFA لمدة 10 إلى 20 ثانية. كرر تسطيح الزعنفة حسب الضرورة. يجب أن تضع الزعنفة الآن مسطحة دون الشباك.
لتخزين عينة طويلة الأجل بعد التثبيت، وغسل الأنسجة مع ثلاثة 20 دقيقة برنامج تلفزيوني يغسل وسلسلة الميثانول التصاعدي. ويمكن بعد ذلك تخزين العينات في 100٪ الميثانول في ناقص 20 درجة مئوية. بالنسبة للتلوين الأحمر Alizarin، rehydrate الميثانول عينات مخزنة في سلسلة الميثانول تنازلي تليها اثنين من يغسل 20 دقيقة في برنامج تلفزيوني وواحد خمس دقائق غسل في الماء الأيونية.
بعد الغسيل الأخير، أضف محلول Alizarin Red إلى عينة الأنسجة وحضن العينة في درجة حرارة الغرفة مع هزاز لفترة التلطخ المناسبة. لمسح العينات، علاج الأنسجة مع انخفاض 1٪ سلسلة هيدروكسيد البوتاسيوم الغليسيرول. ثم تخزين العينات في واحد إلى واحد 0.1٪ هيدروكسيد البوتاسيوم إلى 80٪ محلول الجلسرين وجبل الأنسجة مع 80٪ الجلسرين لتخيل.
لالطين Calcein، احتضان ما يصل إلى ثلاثة حمار وحشي في وقت واحد في 100 ملليمتر من محلول Calcein لمدة 20 دقيقة في كوب زجاجي مغطى برقائق الألومنيوم. في نهاية الحضانة، نقل الحمار الوحشي إلى وعاء من ماء السمك والسماح للأسماك السباحة لفترة وجيزة قبل نقلها إلى حاوية جديدة من مياه السمك. بعد 20 دقيقة في الكوبر الثاني للحصول على صور حية من تجديد الزعانف ، ضع حمار وحشي تخدير على طبق بيتري مغلفة من agarose وصورة الزعنفة عن طريق المجهر ستيريو.
للحصول على صور لعظام الجمجمة المتجددة، ضع سمك الحمار الوحشي منتصبًا في إسفنجة وصور الجمجمة عن طريق المجهر المفلور. العلاج مع بريدنيزولون، على غرار غيرها من جلوكوكورتيكويدات، يؤدي إلى تثبيط شامل لتجديد الزعنفة بما في ذلك تكوين العظام كما تم الكشف عنها من قبل تلطيخ Alizarin الأحمر من الأنسجة الزعنفة السدية الثابتة. وبالمثل ، فإن الدواء له تأثير تأخير على إغلاق إصابة الجمجمة الكالفارية.
بسبب كبت المناعة، يمكن أيضًا اكتشاف أعداد الضامة المنخفضة بواسطة الكيمياء المناعية على أقسام الأنسجة المجمدة كما يتضح من استخدام الأجسام المضادة لـ mCherry والأجسام المضادة لـ GFP التي تلطيخ وصبغة MPEG-1 mChergenic المعدلة وراثياً مع أوستريكس إن إف زيرابفيش على عينات أنسجة الجمجمة للحمار الوحشي من الحيوانات المعالجة بريدنيزولون. أثناء محاولة هذه الإجراءات من المهم تقليل التباين في سرعة تجديد العظام عن طريق تنفيذ المقالات إصابة بطريقة قابلة للاستنساخ للغاية. ومن الأهمية بمكان أيضا أن منزل واحد حمار وحشي في الكواب التي تحتوي على autoclaved المياه الأسماك من أجل تجنب العدوى الميكروبية.
وسيساعد هذا البروتوكول على مواصلة معالجة الآليات الأساسية لعمل جلوكورتيكويد. على سبيل المثال، في سياق جلوككورتيكود الناجمة عن هشاشة العظام ويمكن أيضا أن تتكيف مع استخدام أدوية أخرى وغيرها من عظم حمار وحشي.
