والهدف من هذا بسيطة استنساخ الحيوية 3D الخلايا المستندة إلى نظام لتسهيل تحليل القدرة الغزو في عدد كبير من السكان من ورم spheroid لمضادات النقيلي فحص المخدرات. الميزة الرئيسية لدينا مجموعة الحجرة الصغيرة هيدروجيل هو أنه يسمح لإنتاج عدد كبير من spheroids موحدة التي تملأ نفس الطائرة التنسيق في البئر. يتم الاحتفاظ موقف spheroid بسبب هيكل مجموعة الحجرة الصغيرة hydrogel حتى بعد إضافة مصفوفة خارج الخلية ، مما يسهل الرصد المستمر الدقيق للسفاويدات وعملية الغزو.
وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء التوصيف المورفولوجي وتلطيخ الفلورسنت للعديد من الخلايا الشعاعية والخلايا الغازية في الموقع وتحليلها في قرار من عنصر واحد بطريقة فعالة زمنياً. مما يدل على مجموعة الحجرة الصغيرة هيدروجيل ستة بئر تصوير لوحة عملية الإنتاج سيكون ماريا Sobolev من مختبرنا. لإعداد لوحات الصفيف الحجرة الصغيرة الهيدروجيل، سخني أولاً ستة بوليديميثيلسيلوكسيان، أو PDMS، طوابع إلى 70 درجة مئوية، ووضع لوحة ذات ستة بئرات ذات قاع زجاجي على حمام جاف مدفأة مسبقًا إلى 75 درجة مئوية لعدة دقائق.
عندما تكون اللوحة دافئة ، صب قطرة 400 ميكرولتر من agarose منخفضة ذوبان ما قبل ساخنة على الجزء السفلي من كل بئر من لوحة ستة حسنا ، ووضع بلطف طابع واحد على كل قطرة. السماح الإعداد لتبرد لمدة خمس إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، تليها 20 دقيقة في أربع درجات مئوية لجل أجاروز الكامل. عندما تتوطد agarose، قشر بلطف قبالة PDMS من كل بئر، وترك المواد الهلامية agarose منقوشة مع الغرف الصغيرة.
بعد السماح لمصباح الأشعة فوق البنفسجية للوصول إلى أعلى كثافة، ضع لوحة منقوشة في نظام المعالجة الخفيفة لمدة ثلاث دقائق، وملء الآبار الكلي معقمة الأشعة فوق البنفسجية مع برنامج تلفزيوني عقيمة. ثم، قم بتغطية اللوحة، ولفها بParparfilm لتخزين أربع درجات مئوية حتى الاستخدام. لتحميل الخلايا، قم بإزالة برنامج تلفزيوني من كل بئر، و قم بتحميل 50 ميكرولترات برفق من الخلايا ذات الأهمية فوق كل صفيف هيدروجيل.
بعد السماح للخلايا لتسوية الجاذبية لمدة 15 دقيقة، إضافة بعناية ستة إلى ثمانية aliquots من 500 ميكرولترات من المتوسطة الطازجة إلى حافة القاع البلاستيكي الماكرو جيدا خارج عصابة ومجموعة هيدروجيل. احتضان الخلايا للفترة الزمنية المناسبة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع الرطوبة لتشكيل الزفيرويدات. ثم، نقل spheroids إلى غطاء غطاء للرأس على الجليد لمدة 10 دقائق.
عندما يبرد لوحة، العجاف تلميح ماصة على حافة القاع البلاستيك الماكرو جيدا بجوار مجموعة هيدروجيل، وإزالة كل من المتوسطة من جميع أنحاء الصفيف. ثم، إزالة المتوسطة من خزان الصفيف، العجاف تلميح ماصة هلام تحميل على حافة خزان مجموعة بعناية فائقة، مع الحرص على عدم إزعاج الغرف الصغيرة و spheroids. بعد ذلك ، استخدم طرف ماص ناعم مجمد مسبقًا لإضافة اثنين من aliquots من 150 ميكرولترات من خليط الكولاجين من الفائدة على حافة الصفيف واحد في وقت واحد ، وإطلاق الخليط ببطء لتجنب الخلع الكروي.
بعد إضافة الجولة الثانية من الكولاجين إلى كل بئر ، ارجع الرغوة إلى الحاضنة لمدة ساعة واحدة للحصول على النخاع الكامل للمصفوفة خارج الخلية. عندما تتوطد المصفوفة، إضافة 400 ميكرولترات من ما قبل warmed 1٪ منخفضة ذوبان agarose على رأس الجل، واحتضان لوحة، مغطاة في درجة حرارة الغرفة، لمدة خمس إلى سبع دقائق، قبل التبريد لمدة دقيقتين في أربع درجات مئوية لgelation agarose. ثم، يميل ماصة على حافة القاع البلاستيك الماكرو جيدا، إضافة بلطف ملليلتر من متوسطة كاملة لكل بئر.
لإجراء فحص الغزو، تحميل لوحة صفيف الحجرة الصغيرة hydrogel على مرحلة المجهر المقلوب الآلية مجهزة حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون مع الغلاف الجوي المرطب، واستخدام هدف أربعة أو 10x لتحديد ما قبل المواقف للحصول على صورة في كل بئر بحيث سيتم تقييم منطقة الصفيف بأكملها. ثم، الحصول على صور المجال الساطع كل ساعتين إلى أربع ساعات لما مجموعه 24 إلى 72 ساعة لتتبع غزو الخلية من الجسم spheroid إلى المصفوفة خارج الخلية المحيطة. في نهاية الحصول على الصورة، قم بتصدير الصور الفاصلة زمنياً من برنامج الحصول على الصور لحفظها في تنسيق ملف صورة معلّم إلى مجلد مخصص.
بعد ذلك، افتح واجهة مستخدم الرسومات، ثم انقر فوق تحميل حقل مشرق. ضبط معلمات التجزئة للصورة لتحقيق تجزئة دقيقة من spheroids ومناطق الغزو الخاصة بهم، وانقر فوق منطقة من تجزئة الفائدة لإنشاء حد حول كل spheroid. إذا كان التقسيم التلقائي غير صحيح، اضغط Delete أو Add، وقم بإجراء التصحيحات المناسبة يدوياً.
انقر فوق تعقب لترقيم spheroids في كل من الصور الفاصل الزمني. ثم انقر فوق قياس لإنشاء جدول بيانات يتضمن كافة المعلمات، ثم احفظ جدول البيانات بتنسيق مناسب لمعالجة البيانات والتحليل الإحصائي. لدراسة تأثير حمض الهيالورونيك على عملية الغزو الطورئي التلقائي HeLa ، في هذه التجربة ، تم تغطية الزفويد التي بلغت يومين مع الكولاجين ومحلول خليط حمض الهيالورونية ومقارنتها مع الزفويد التي نضجت لمدة يومين مغطاة بمحلول الكولاجين وحده.
بعد 50 ساعة من الحضانة، أظهر الزاويين المدمجة في الكولاجين وحمض الهيالورونية تشتت الخلايا السفلي في المصفوفة الخارجية الخلية المحيطة مقارنة بالزاويات المضمنة في الكولاجين وحده. في الواقع، تحليل حركية منطقة الغزو مع مرور الوقت ل99 spheroids في قرار واحد spheroid يشير بوضوح إلى أن إضافة حمض الهيالوروقية إلى الكولاجين يمنع تشتت الخلايا من spheroid، مما يؤدي إلى مناطق الغزو أصغر. علاج ثقافة الهيلا spheroid مع الفلافونويد النشط بيولوجيا مع خصائص السياتو والميغراتاتاتيكية لمدة 24 ساعة النتائج في تشتت الخلايا المثبطة حول spheroids مقارنة مع غير المعالجة HeLa spheroids.
في الواقع ، كشف تحليل مناطق الغزو من 488 spheroids في نهاية التجربة تثبيط كبير بعد العلاج مع أقل من 10 ميكرومولار من الدواء. بسبب انخفاض خصائص المرفق الهيدروجيل، وهذه التكنولوجيا غرفة صغيرة القائمة على تسهيل تشكيل spheroid حتى في حالات عدد قليل جدا من الخلايا. هذه ميزة خاصة في قيمة محدودة السرطان الجذعية مثل أو المريض المستمدة من عينات الخلايا الأولية.
وتتيح لوحة التصوير في الحجرة الصغرى الهيدروجيل تحليل الموقع المكاني الدقيق للزوافير خلال التجارب الطويلة الأجل لتقييم عملية الغزو على مستوى عنصر واحد وتوفر درجة عالية من المتانة الإحصائية والدقة. وتشمل التطبيقات المستقبلية لهذه المنهجية جنبا إلى جنب زراعة الخلايا المتعددة من الخلايا الورم والخلايا السترومال في مناطق مختلفة داخل بئر الماكرو واسترجاع spheroids الفردية للتحليل الجزيئي المصب.
