هذا الأسلوب متقدم جداً. لديها أقسام في مجال التكنولوجيا الحيوية مثل هندسة الأنسجة والعلاج التوليدي المجاني وفحص المخدرات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن المجاميع حجم موحدة يمكن أن تنتج في ثقافة بسيطة والتعليق.
ويمثل هذا اللوح إمكانية وجود سفن جديدة على شكل حرف O لإنتاج مجاميع موحدة من خلايا الثدييات في ثقافة التعليق الاهتزاز المداري. في ثقافة الهز المداري مع السفن التقليدية ، يحدث التدفق الدائري بسبب قوة الطرد المركزي للسطح المتوسط ، وينقل هذا التدفق المتوسط الخلايا نحو وسط القاع من السفن. هذا التأثير هو معروف جيدا باسم آينشتاين الشاي ورقة مفارقة.
هذا التأثير يسبب تراكم الزائدة من الخلايا في وسط أسفل الخلايا وتجميع غير متجانسة. من ناحية أخرى، أوعية على شكل O القضاء على المنطقة الوسطى التي تمنع الخلايا كاسحة تدفق المتوسطة في منطقة وسط القاع. وهذا يحد من تراكم الخلايا التي يمكن أن تحقق التجميع متجانسة.
تبدأ مع قارورة 25 سم مربع من خلايا HEK-293 لكل سفينة أن يجلس. افصل الخلايا باستخدام 0.25٪ تريبسين-EDTA حل وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. إعادة تعليق بيليه الناتجة في ملليلتر واحد من المتوسطة الثقافة.
قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلايا 40 ميكرون لجمع تعليق أحادي الخلية. إضافة Trypan الأزرق إلى aliquot من تعليق الخلية وإجراء عدد الخلايا. ثم إعداد 20 ملليلتر من تعليق الخلية في 2 مرات 10 إلى الخلايا 5 في المليلتر.
قم بتوصيل مدخل الكيس على شكل O بحقنة 50 ملليلتر مشبكة ثم قم بفصل المكبس. خفض تعليق الخلية المعدة في كيس على شكل O من خلال حقنة فرضت. استبدال الحقنة المشبك الأول مع حقنة نظيفة.
إضافة 55 ملليلتر من الهواء من خلال حقنة نظيفة لتوسيع الحقيبة تماما. رفرف أنبوب مدخل ثم أغلق المدخل. وأخيرا، إزالة المشبك من الأنبوب.
احتضان الخلايا في كيس على شكل O مع اهتزاز في 45 دورة في الدقيقة في ظروف 35 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. لتغيير الوسط في الخلايا، قم أولاً بنقل تعليق الخلية إلى أنبوب 50 ملليلتر، عبر المدخل. ثم الطرد المركزي لمدة دقيقتين في 200G في درجة حرارة الغرفة.
بعد التعرق، إضافة 20 ملليلتر من الثقافة المتوسطة وإعادة تعليق الخلايا. إضافة الخلايا resuspended إلى كيس على شكل O كما كان من قبل وإعادة كيس مختومة إلى حاضنة تهتز. لجمع الخلايا، نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 50 ملليلتر من خلال مدخل، كما كان من قبل.
اغسل داخل الكيس بـ 20 ملليلتر من الكالسيوم والمغنيسيوم الخالي من الفوسفات والملوحة العازلة ثم استنزف المحتويات في أنبوب لجمع الخلايا المتبقية من الحقيبة. الطرد المركزي تعليق الخلية التي تم جمعها لمدة ثلاث دقائق في 200 مرة G في درجة حرارة الغرفة ومن ثم الpirate supernate. إضافة 10 ملليلتر من الكالسيوم، المغنيسيوم برنامج تلفزيوني مجانا ومشاهدة المجاميع.
بعد الطرد المركزي كما كان من قبل، وإزالة supernate وترك بيليه تحتوي على المجاميع. إذا كان هناك حاجة إلى عدد الخلايا، أضف أربعة ملليلترات من PBS ومليلتر واحد من التربسين إلى المجاميع واحتضان لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية لفك الخلايا للعد. وتبين القياسات التجريبية أن المجاميع التي تزرع في الطبق التقليدي، كانت لها أقطار متفاوتة بعد خمسة أيام في الاهتزاز المداري.
في المقابل، كان المجاميع التي تزرع في أطباق أو أكياس على شكل O لمدة خمسة أيام، أقطار أكثر اتساقا. وفقا لقياس حجم الصورة القائمة على, وأظهرت ثقافة طبق التقليدية اثنين من القمم المختلفة, مما يدل على انحراف واسع من حجم الكلي. من ناحية أخرى، أظهرت المجاميع في الأطباق على شكل O والحقائب على شكل O ذروة واحدة وانحراف أقل في القطر من تلك الموجودة في الطبق التقليدي، مما يشير إلى أن مثل هذه المجاميع قد تكون ذات جودة أكثر اتساقا.
Haematoxylin وeosin-تلطيخ من المقاطع العرضية الكلية، وأظهرت أن المجاميع التي تزرع في الطبق التقليدي كان بعض الخلايا الناسخة ومسار نخري؛ ولكن المجاميع التي نمت في السفن على شكل O لم تظهر أي مسار والمجاميع التي تزرع في كيس على شكل O كانت كبيرة مثل تلك الموجودة في الطبق التقليدي. وأظهرت أعداد الخلايا أن أكثر من 85٪ من الخلايا نجا لمدة خمسة أيام من ثقافة التعليق في كل سفينة. يوضح هذا الفيديو كيفية التعامل مع رواية على شكل سفن O لإنتاج مجاميع موقع موحدة من خلايا الثدييات في ثقافة تعليق بسيطة.
