الهدف العام لهذا الإجراء هو بناء نموذج انحداري للتنبؤ بطفيليات الملاريا باستخدام التحليل الطيفي ATR-FTIR مع تحليل البيانات متعددة المتغيرات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تسريع تشخيص نقاط الرعاية التي يمكن أن تساعد في تحسين نتائج المرضى في المستقبل. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه في حين أن النموذج قد يستغرق بعض الوقت لبناء, فمن المحمولة للغاية, سهلة الاستعمال, حساسة للغاية, ومنخفضة التكلفة.
وعلى الرغم من أن هذه الطريقة تمكن من تحديد كمية طفيليات الملاريا، إلا أنه يمكن استخدامها أيضاً لمراقبة استجابة الظاهريات للتغيرات البيئية مثل التغيرات في تكوين الطفيليات بسبب العوامل المضادة للميكروبات. الفكرة تطورت من العمل الذي قمنا به في السنكروترون الأسترالي على الخلايا المصابة بالملاريا. كان هذا على مستوى الخلية الواحدة.
من هناك، قررنا استخدام التحليل الطيفي ATR-FTIR لتطوير الاختبار التشخيصي في الواقع. قبل البدء في إجراء التزامن ، والثقافة 30 ملليلتر من 3D7 سلالة الطفيليات فالسيباروم Plasmodium كما هو موضح في بروتوكول النص. باستخدام ماصة مؤتمتة، resuspend الثقافة ونقلها إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.
أجهزة الطرد المركزي في الثقافة في 300 إلى 400 مرة ز في ظل ظروف المختبر القياسية لمدة خمس دقائق. إزالة المابير عن طريق رسمها مع ماصة الآلي دون إزعاج بيليه. تجاهل وسائل الإعلام النفايات في حل 10٪التبييض.
إضافة ببطء 12 إلى 15 ملليلتر من محلول السوربيتول 4٪ إلى بيليه وخلط الثقافة عن طريق تغطية وعكس الأنبوب حتى الثقافة متجانسة. احتضان الثقافة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد 15 دقيقة، جهاز طرد مركزي الثقافة لمدة خمس دقائق.
استخدام ماصة الآلي لإزالة افرات دون إزعاج بيليه. إضافة 10 إلى 15 ملليلتر من 0.9٪ ملحي إلى بيليه وخلط الحل عن طريق وضع حد لمعادلة وعكس الأنبوب حتى تكون الثقافة متجانسة. كرر الطرد المركزي والمحلول الملحي غسل مرتين أكثر لإزالة جميع بقايا السوربيتول.
لبدء هذا الإجراء، الطرد المركزي مخزون خلايا الدم الحمراء، أو RBCs. إزالة افرنح وغسل مع 0.9٪ المالحة ما مجموعه ثلاث مرات. الطرد المركزي الأسهم RBCs والثقافة في 300 إلى 400 مرات ز لمدة خمس دقائق والتخلص من افرط من كل أنبوب.
تسمية ثمانية أنابيب microcentrifuge كما هو مبين. ثم استخدم ماصة 0.2 إلى 20 ميكرولتر لإضافة الكمية المناسبة من الثقافة لكل أنبوب. بعد ذلك ، أضف الكمية المناسبة من الأسهم RBCs لكل أنبوب للحصول على تخفيف الطفيليات المرغوب فيها.
أجهزة الطرد المركزي الدم المتبرع الطازجة التي تم جمعها في أنابيب تخثر في 1، 200 مرة ز والظروف المختبرية القياسية لمدة 10 دقائق. إزالة البلازما عن طريق رسمها مع ماصة والتخلص منه في حل 10٪التبييض. إضافة 900 ميكرولترات من RBCs المانحة المعزولة في كل أنبوبrifuge microcentuge ومزيج دقيق عن طريق عكس 10 مرات.
وسيتم استخدام بسيطة benchtop atuated الانعكاس الكلي فورييه تحويل الأشعة تحت الحمراء، أو مطياف ATR-FTIR للحصول على الطيف. إعداد وتنظيف الكريستال باستخدام مناديل خالية من الوبر مبللة بالماء النقي جدا لفرك بلطف الكريستال في حركة دائرية. ثم، استخدام آخر مسح خالية من الوبر لتجفيف بدقة الكريستال.
اتخاذ قياس الخلفية من الهواء عن طريق النقر فوق قياس الخلفية. كل 20 دقيقة، وتنظيف الكريستال وتكرار هذا القياس. افتح العرض المباشر بالنقر فوق معاينة.
لاحظ خط أساس أفقي مسطح يشير إلى أن البلورة نظيفة. Pipette 10 ميكرولترات من المياه ديوند مباشرة على منتصف الكريستال وانقر فوق قياس العينة. جفف الكريستال باستخدام مسح خال من الوبر والحركة الدائرية اللطيفة.
Pipette 10 ميكرولترات من عينة على منتصف الكريستال وانقر فوق قياس العينة. تنظيف الكريستال بين العينات. في هذا العرض التوضيحي، سيتم إجراء تحليل البيانات متعددة المتغيرات باستخدام MATLAB.
لبدء معالجة البيانات، تحليل الإدخال في إطار الأوامر لفتح واجهة مستخدم الرسومات. انقر بزر الماوس الأيمن فوق المربع س للعثور على استيراد البيانات. حدد نوع الملف للتحليل.
استيراد العينة والمياه وأطياف الأساس كـ مجموعات بيانات في مكان العمل عن طريق تحديد كل الأطياف في كل مجموعة على حدة، والنقر فوق فتح، وإعطاء كل مجموعة اسمًا قصيرًا. انقر فوق متغير جديد في إطار الأوامر وإعطاء ناقلات اسم الطفيليات. إدخال الطفيليات من كل عينة.
انقر بزر الماوس الأيمن فوق المربع X للبحث عن بيانات الرسم. انقر فوق رمز بيانات الرسم لرسم البيانات. فحص الأطياف لتأثيرات بخار الماء عن طريق النقر على التكبير والتكبير على 1، 800 إلى 1، 400 لكل سنتيمتر، لوحظ بشكل واضح على أنها قصيرة، حادة، قمم ضيقة على طول سفوح النطاقات أميد الأول وأيديش الثاني.
في حالات بخار الماء الشديد، افتح علامة التبويب تحرير البيانات قبل المعالجة وحدد النعومة. تقليل الضوضاء و / أو مساهمات بخار الماء القوية عن طريق تجانس العينة وأطياف المياه. بعد معالجة البيانات كما هو موضح في بروتوكول النص، افتح علامة التبويب تحرير البيانات، وفي متغيرات الأعمدة، حدد 2980 إلى 2800 لكل سنتيمتر ومن 1750 إلى 850 لكل سنتيمتر عن طريق التأكد من وضع علامة على مربعاتها فقط.
البيانات جاهزة الآن للتحليل. لتنفيذ تحليل المكون الأساسي أو PCA، انقر فوق تحليل التحليل وحدد PCA. انقر فوق إنشاء طراز.
مراقبة حد الثقة 95٪، حلقة متقطعة، على مؤامرة عشرات بين PC 1 و PC 2. استخدم أداة تحديد الأطياف لتحديد أطياف العينة مع الدرجات التي تحدث خارج الحد كتهامات خارجية محتملة. لتنفيذ انحدار مربعات جزئية أقل، أو PLSR، انقر فوق تحليل الانحدار وحدد PLSR.
انقر بزر الماوس الأيمن فوق كتلة Y وحدد نموذج بناء الطفيليات المتجهة. تحليل نموذج الانحدار و متجه الانحدار وتحديد النطاقات البيولوجية. جزئية أقل المربعات مخطط الانحدار من RBCs ارتفعت بين صفر إلى واحد في المئة Parasitemia ولدت قيمة R-تربيع من 0.87 و جذر متوسط مربع خطأ التحقق من صحة الصليب من 0.13٪ الطفيلي.
وهذا يدل على قدرة النموذج على التنبؤ الطفيلي في كل عينة مع الطفيليات المعروفة على محور س و الطفيليات المتوقعة على المحور ص. ويصف معامل الانحدار المرتبط به مساهمة كل نطاق في القدرة التنبؤية للنموذج. كلما كان النطاق أكثر كثافة ، كلما ساهم في النموذج ، وبالتالي ، كيف يغير الطفيلي التركيب الكيميائي للدم.
وتبين النتائج أن الإشارة من الطفيليات متميزة بما فيه الكفاية عن الـ RBCs بحيث يمكن استخدامها لتشكيل نموذج انحدار خطي للتنبؤ بالطفيليات في مجموعات البيانات المستقبلية. بمجرد اتقانها، يمكن أن تستغرق هذه التقنية أقل من ثلاث دقائق لكل عينة إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر لتنظيف بلورات ATR من جميع المخلفات.
بعد هذا الإجراء، يمكن نمسخ أنواع أخرى من الملاريا مثل P vivax و P الملاريا من أجل الإجابة على مثل هذه الأسئلة مثل، هل ATR-FTIR الطيفي حساسة بما يكفي للتمييز بين الأنواع؟ بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الفحص البيولوجي لاستكشاف الكشف عن وتكميم مسببات الأمراض الأخرى المنقولة بالدم وحتى التحليل في الدم مثل الجلوكوز واليوريا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد للطيفية ATR -FTIR وتحليل NVDA لبناء نموذج الانحدار.
لا تنس أن العمل مع عينات دم المريض والملاريا يمكن أن يكون خطيرا، وينبغي دائما التدريب المناسب على مستوى السلامة الحيوية والاحتواء عند محاولة هذا الإجراء.
