Name: isolation and characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar chromatin organization
Uploaded: 2016-01-07T12:00:01.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization at JoVE.com

M.M. and C.A.R. acknowledge the financial support of the Ministero della Salute, Ricerca Finalizzata/giovani ricercatori anno 2009 of the Fondazione IRCCS Ospedale San Matteo, Pavia (I). M.M and C.A.R. wish to thank Marianna Longo for helping with the images preparation.

ويجري هذا البروتوكول وفقا للمبادئ التوجيهية لالأوروبي (EU 63/2010) والإيطالية (26/2014) قوانين حماية الحيوانات المستخدمة لأغراض البحث العلمي. يستخدم عنق الرحم التفكك القتل الرحيم لالمبايض العزلة، ويتم تنفيذها من قبل الخبراء والأفراد المدرجة في بروتوكول المعتمد تغطي هذه الدراسة تدريب. 1. الحيوانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الكبار 3- لإناث الفئران عمره 6 أسابيع في غرفة مع درجة الحرارة للرقابة والرطوبة (مع مراحل 12L: 12D وبالمال وبالشهرة أيضا إعلان البنك المركزي الامريكي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن الفئران داخل الصفاق مع 2.5 وحدة دولية من الحوامل موجهة الغدد التناسلية مصل الفرس (PMSG) لتحفيز النمو الجريبي عن طريق محاكاة آثار هرمون تحفيز الجريبات (FSH). عزل المبيضين البويضات لالغارية 48hrs جمع في وقت لاحق. الموت ببطء الماوس الإناث حقن سابقا مع PMSG، وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية الخاصة بك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بسرعة إزالة المبيضين من تجويف الجسم ووضعها في طبق بتري تابعaining M2 المتوسطة لاحقة عزل البويضات (انظر القسم 3). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق في الجلد الذي يغطي جدار البطن تليها شق في الغشاء البريتوني باستخدام مقص تشريح العقيمة. فتح شق لكشف البطن، نقل الشجاعة على جانب واحد باستخدام الملقط معقمة وتوطين أنابيب الرحم، وتشكيل شكل V بدءا من المثانة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة المبايض تقع تحت الكلى. عقد كل أنبوب مع منتاش معقم وإجراء شق صغير في الجزء السفلي من المبيض للافراج عنهم. نقل كلا المبيضين في الجزء السفلي من طبق بتري تحتوي على المتوسط ​​قبل معايرتها. </li></ol></li></ol> 2. إعداد هرمون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع PMSG (متوفر في تركيزات مختلفة الأسهم) مع محلول معقم المالحة متساوي التوتر للحصول على تركيز العمل من 2.5 وحدة دولية الهرمون في 0.1 مل لحجم الحقن المناسب. يجب aliquoted حلول هرمون في 0.5 مل الأنابيب وتخزينها في -2: ملاحظة0 درجة مئوية حتى اليوم من الاستخدام. لا تبقي قسامات المخفف أطول من ثلاثة أشهر في -20 ° C. إذابة مرة واحدة، إذا تم إجراء حقن المسلسل، وتخزين aliquots من الحلول الهرمون في +4 درجة مئوية واستخدامها في غضون 4 أيام. </li></ol> 3. الغارية البويضات عزل لعزل البويضات السليمة: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتوازن M2 المتوسطة 13 (M2) في CO 2 و 37 ° C 5٪ لا يقل عن 1 ساعة قبل البدء في إجراء البويضات العزلة. إعداد طبقين بتري (35 مم × 10 مم)، واحدة مع 1 مل من M2 لتعطيب المبيض والثانية مع قطرات صغيرة (20 ميكرولتر) من M2 مغطاة الزيوت المعدنية (~ 1.5 مل) لنقل البويضات بعد بمعزل عن المبيض (انظر 3،4-3،6). تبقي على حد سواء أطباق بتري في حاضنة في 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام stereomicroscope خلال إجراءات عزل البويضات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد رقيقة الماصات الزجاجية الفم لجمع البويضات تمتد لفيلمأبقى هينج الزجاج الماصات باستور أفقيا (عقد ينتهي من ماصة بكلتا يديه)، فوق لهب العمودي القادمة من موقد بنسن (الشكل 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد أن يبدأ الزجاج في الذوبان، واتخاذ الماصة للخروج من اللهب وإجراء حركة سحب سريعة للحصول على ماصة المطلوب. قطع بحزم الزجاج الزائد على مقربة من نقطة ضيقة من ماصة مع الأظافر لضبط طول وقطر الشعرية الداخلي. ضمان الشعرية رقيقة لديه القطر الداخلي لل~ 100 ميكرون، أكبر قليلا من قطر البويضة ل(~ 80 ميكرون). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى الفم ماصة، قم بتوصيل أحد طرفي الأنبوب الشافطة لماصة سحبت باستخدام طرف المناسب ووضع الطرف الآخر في الفم، وتأمين ذلك مع الأسنان. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع المبايض باستخدام الملقط معقمة وإيداعها في الجزء السفلي من طبق خلية ثقافة بتري (35 ملم × 10 ملم). غطاء لهم مع 1 مل من M2 سبق معايرتها عند 37 ° Cو 5٪ CO 2 (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقب بلطف الجريبات الغارية المبيضين مع العقيمة إبرة حقنة الانسولين لاطلاق سراح البويضات الغارية في M2 (الشكل 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف الفم الماصة البويضات من خلال ماصة باستور الضيقة لإزالة خلايا بصيلات وأي حطام الأنسجة المحتمل الآخر (الشكل 4A) ومن ثم تسويتها في الجزء السفلي من قطرات صغيرة (20 ميكرولتر) من M2 مغطاة الزيوت المعدنية مناسبة للثقافة الجنين (سابقا إعداد؛ الشكل 4B). ملاحظة: من المهم لإزالة جميع الخلايا الركامية التي تعلق على المنطقة الشفافة من البويضات قبل pipetting المستمر من خلال عدة ومختلفة قطرات من M2. تنفيذ هذه الخطوة في أسرع وقت ممكن لتجنب التغيرات في الرقم الهيدروجيني للمتوسط. </li></ol> 4. الغارية البويضات تلطيخ مع Hoechst33342 ملاحظة: البويضات الغارية ويمكن التمييز في SN (تحيط نوية)، NSN (لا تحيط نوية) أوفي أي شكل وسيط آخر، استنادا إلى منظمة ونين بهم بعد تلطيخ مع تركيز فوق حيوي من Hoechst33342 (أو أي علامات أخرى محددة لقواعد AT) 14. في الواقع، تظهر البويضات SN حلقة هويشت إيجابية حول نوية في حين أن NSN لا، ومن هنا اسمها. لتلطيخ البويضات السليم: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البويضات باستخدام ماصة الفم إلى قطرات من Hoechst33342 (20 ميكرولتر) المخفف في M2 في تركيز فوق حيوي من 50 نانوغرام / ميكرولتر لمدة 10 دقيقة في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة مع Hoechst33342، ونقل كل بويضة واحدة مع ماصة الفم في الجزء السفلي من قطرات صغيرة (5 ميكرولتر) من M2 مغطاة الزيوت المعدنية، والفرز على أساس تنظيم لونين (SN أو NSN). استخدام أي المجهر مضان مجهزة مرشح Hoechst33342 (الطول الموجي انبعاث 486 نانومتر) لتصور التكوين لونين من البويضات. ملاحظة: اعتمادا على نوع المجهر مضان المستخدمة، طر قد يصبح من الضروري استخدام الزجاج طبق بتري أسفل لالتقاط صور. المجهري متحد البؤر أوليمبوس Fluoview Fv10i عندما مجهزة حامل العينة لمدة 35 ملم طبق يتطلب الزجاج الوحيدة أسفل أطباق لالتقاط صور مع 0.17 مم القياسية ومجموعة 0،13-0،21 مم مقبولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تثير البويضات لمدة لا تزيد 5-10 ثانية، من المحتمل ما يكفي من الوقت لتصور وجود أو عدم وجود حلقة حول نوية (الشكل 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الفرز، وثقافة SN غاري والبويضات NSN في M2 في 5٪ CO 2 و 37 ° C للحث في المختبر النضج أو الاحتفاظ بها في مخازن مناسبة للالتحليلات الجزيئية أو الخلوية. </li></ol>

<ol>
	<li>Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antral+follicles:+oocyte+nucleus+and+the+karyosphere+formation+(electron+microscopic+and+autoradiographic+data).">Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data).</a> Gamete Res. 22 (2), 219-231 (1989).</li><li>Anderiesz, C., Ferraretti, A. P., Magli, C., Fiorentino, A., Fortini, D., Gianaroli, L., Jones, G. M., Trounson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+recombinant+human+gonadotropins+on+human,+bovine+and+murine+oocyte+meiosis,+fertilization+and+embryonic+development+in+vitro.">Effect of recombinant human gonadotropins on human, bovine and murine oocyte meiosis, fertilization and embryonic development in vitro.</a> Human Reprod. 15 (5), 1140-1148 (2000).</li><li>Mattson, B. A., Albertini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis:+Chromatin+and+microtubule+dynamics+during+meiotic+prophase.">Oogenesis: Chromatin and microtubule dynamics during meiotic prophase.</a> Mol. Reprod. Dev. 25 (4), 374-383 (1990).</li><li>Debey, P., Szollosi, M. S., Szollosi, D., Vautier, D., Girousse, A., Besomber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competent+mouse+oocytes+isolated+from+antral+follicles+exhibit+different+chromatin+organization+and+follow+different+maturation+dynamics.">Competent mouse oocytes isolated from antral follicles exhibit different chromatin organization and follow different maturation dynamics.</a> Mol. Reprod. Dev. 36 (1), 59-74 (1993).</li><li>Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+organisation+during+mouse+oocyte+growth.">Chromatin organisation during mouse oocyte growth.</a> Mol. Reprod. Dev. 41 (1-2), 479-485 (1995).</li><li>Wu, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+oocytes+for+in+vitro+maturation+by+brilliant+cresyl+blue+staining:+a+study+using+the+mouse+model.">Selection of oocytes for in vitro maturation by brilliant cresyl blue staining: a study using the mouse model.</a> Cell Res. 17, 722-731 (2007).</li><li>Opiela, Y., K&#261;tska-Ksi&#261;&#380;kiewicz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+utility+of+Brilliant+Cresyl+Blue+(BCB)+staining+of+mammalian+oocytes+used+for+in+vitro+embryo+production+(IVP).">The utility of Brilliant Cresyl Blue (BCB) staining of mammalian oocytes used for in vitro embryo production (IVP).</a> Reproductive Biol. 13, 177-183 (2013).</li><li>Labrecque, R., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+study+of+mammalian+oocyte+competence+by+transcriptome+analysis:+progress+and+challenges.">The study of mammalian oocyte competence by transcriptome analysis: progress and challenges.</a> Mol. Human Reprod. 20 (2), 103-116 (2014).</li><li>Monti, M., Zanoni, M., Calligaro, A., Ko, M. S., Mauri, P. L., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+arrest+and+mouse+antral+Not-Surrouded+Nucleolus+oocyte.">Developmental arrest and mouse antral Not-Surrouded Nucleolus oocyte.</a> Biol. Reprod. 88 (1), 1-7 (2013).</li><li>Yurttas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+PADI6+and+the+cytoplasmic+lattices+in+ribosomal+storage+in+oocytes+and+translational+control+in+the+early+mouse+embryo.">Role for PADI6 and the cytoplasmic lattices in ribosomal storage in oocytes and translational control in the early mouse embryo.</a> Development. 135 (15), 2627-2636 (2008).</li><li>Li, L., Baibakov, B., Dean, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subcortical+maternal+complex+essential+for+preimplantation+mouse+embryogenesis.">A subcortical maternal complex essential for preimplantation mouse embryogenesis.</a> Dev. Cell. 15 (3), 416-425 (2008).</li><li>Ami, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FT-IR+spectra+signatures+of+mouse+antral+oocytes:+molecular+markers+of+oocyte+maturation+and+developmental+competence.">FT-IR spectra signatures of mouse antral oocytes: molecular markers of oocyte maturation and developmental competence.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1813 (6), 1220-1222 (2011).</li><li>Fulton, B. P., Whittingam, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+mammalian+oocytes+by+intercellular+injection+of+calcium.">Activation of mammalian oocytes by intercellular injection of calcium.</a> Nature. 273 (5658), 149-151 (1978).</li><li>Luttmer, S. J., Longo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+living+and+fixed+gametes+and+early+embryos+stained+with+supravital+fluorochromes+(Hoechst+33342+and+3,3&#8242;-dihexyloxacarbocyanine+iodide).">Examination of living and fixed gametes and early embryos stained with supravital fluorochromes (Hoechst 33342 and 3,3&#8242;-dihexyloxacarbocyanine iodide).</a> Gamete Res. 15 (3), 267-283 (1986).</li><li>Monti, M., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biopolitics+of+frozen+embryos.">The biopolitics of frozen embryos.</a> Int. J. Dev. Biol. 55, 243-247 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

يصف هذا البروتوكول الطريقة المستخدمة لعزل وتصنيف الماوس غاري البويضات GV. لا توجد خطوات حاسمة خاصة أن نؤكد، مع استثناءات قليلة. أولا: يجب أن يتم تنفيذ هذا الإجراء في أسرع وقت ممكن بما يلي: أ) الحفاظ على حيوية البويضات وب) تجنب التغييرات درجة الحموضة في الوسيلة المستخدم?...

وتستخدم غاري البويضات نمت بشكل كامل (GV، الحويصلة الجرثومية) معزولة عن مقصورة الغارية من المبيض بشكل روتيني لأغراض مختلفة مثل، على سبيل المثال، ودراسة الآليات الجزيئية والخلوية وراء في المختبر النضج حتى مرحلة الطورية II. وعلى الرغم من ظهور البويضات الأكثر الغارية جميلة، ولكن ليس كل شيء، هي قادرة على استكمال الانقسام الاختزالي والوصول إلى مرحلة الكيسة الأريمية. في الواقع، في كثير من أنواع الثدييات، بما في ذلك البشر 1،2، ما يقرب من 30٪ منهم تعتقل تنميتها في المرحلة 2-الخلية، في حالة حدوث الإخصاب 3-5. حتى الآن، تستخدم بعض المعلمات للتمييز بين البويضات قادرة على الحفاظ على التطور الجنيني من أولئك الذين لا يستطيعون القيام بذلك. على سبيل المثال، الكريزيل تلطيخ الأزرق (BCB) هو وسيلة صالحة لفرز البويضات على أساس النشاط الجلوكوز 6 فوسفات نازعة-على الرغم من أن فائدة هذه الطريقة فرز المتعلقة BCB + أو تلطيخ BCB- هيلا يزال المختبرات تعتمد 6-8. يوجد طريقة أخرى راسخة في المؤسسة لونين بها: إذا ملطخة أي الأصباغ الإقحام الحمض النووي (مثل Hoechst33342)، و 70٪ من البويضات الغارية تظهر حلقة صبغ إيجابي حول نوية وتسمى تحيط نوية (SN) في حين أن 30٪ المتبقية تظهر إشارات إيجابية أكثر رصدت وتسمى ليس تحيط نوية (NSN) 3-5. أظهرنا مؤخرا أن غياب السياج حشوية 9 (CPLs، مواقع تخزين هامة لمرنا وريبوسوم المستمدة أمهات في كل من البويضات في الثدييات والأجنة) (10) وأسفل تنظيم MATER (ضروري لتشكيل CPLs 11)، جنبا إلى جنب مع وجود قطرات الدهون في cytoplasms من 9،12، يمكن أن يكون لأسباب أخرى تتعلق البويضات عدم NSN المضي قدما إلى ما بعد مرحلة 2-الخلية. للأسف، عدد من التقنيات يمكن تطبيقها على فرز SN الغار والبويضات NSN و،لهذا السبب، يمكن تطوير أسلوب أقل الغازية (دون تلطيخ النووي، إجراءات تثبيت أو التلاعب مع ماصات الفم) أصبحت مهمة جدا لزيادة معدلات كلا تطور الجنين الإنسان والحيوان. في هذه الورقة، ونحن بالتفصيل بروتوكول بسيطة وسريعة تستخدم لعزل الإعلان نوع SN وNSN البويضات الغارية من إناث الفئران وموجهة الى جميع العلماء المهتمين في دراسة عملية تكوين الأمشاج الإناث، نضوج البويضة وتطور الجنين.

<table><tbody><tr><td>PMSG</td><td>Sigma</td><td>G4527</td><td></td></tr><tr><td>EmbrioMax M2</td><td>Millipore</td><td>MR-015-PD</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Dish 35mmx10mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>&amp;micro;-Dish 35mm, high glass bottom</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur Borosilicate</td><td>Corning</td><td>7095D-9</td><td></td></tr><tr><td>Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettes</td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar chromatin organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures. 
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

وتظهر الصور التالية الطريقة المستخدمة لعزل البويضات الغارية من المبيض الماوس، بدءا من إعداد الماصات لفرز البويضات عن طريق وسائل Hoechst33342. هذا الأسلوب هو بسيط جدا ويمكن أن يؤديها في أي مختبر مجهز حاضنة CO 2، stereomicroscope والمجهر مضان مجهزة مرشح الصحي...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization at JoVE.com

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

هنا نقدم بروتوكول لتوصيف البويضات غاري الماوس على أساس تنظيم نويي.

عزل وتوصيف ماوس الغارية البويضات واستنادا إلى منظمة ونين نويي

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

isolation-characterization-mouse-antral-oocytes-based-on-nucleolar

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.3K Views.  Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo.  هنا نقدم بروتوكول لتوصيف البويضات غاري الماوس على أساس تنظيم نويي. 

Video: Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for spermatogenesis. These techniques allow for visualization of protein and DNA localization patterns during meiotic events such as homologous chromosome pairing, synapsis and DNA repair. While a few protocols have been described in the literature, general chromatin spread techniques using mammalian prophase oocytes are limited and difficult due to the timing of meiosis initiation in fetal ovaries. In comparison, prophase spermatocytes can be collected from juvenile male mice with higher yields without the need for microdissection. However, it is difficult to obtain a pure synchronized population of cells at specific stages due to the heterogeneity of meiotic and post-meiotic germ cell populations in the juvenile and adult testis. For later stages of meiosis, it is advantageous to assess oocytes undergoing meiosis I (MI) or meiosis II (MII), because groups of mature oocytes can be collected from adult female mice and stimulated to resume meiosis in culture. Here, methods for meiotic chromatin spread preparations using oocytes dissected from fetal, neonatal and adult ovaries are described with accompanying video demonstrations. Chromosome missegregation events in mammalian oocytes are frequent, particularly during MI. These techniques can be used to assess and characterize the effects of different mutations or environmental exposures during various stages of oogenesis. As there are distinct differences between oogenesis and spermatogenesis, the techniques described within are invaluable to increase our understanding of mammalian oogenesis and the sexually dimorphic features of chromosome and protein dynamics during meiosis.

Oogenesis in mammals is known to be error-prone, particularly due to chromosome missegregation. This manuscript describes chromatin spread preparation methods for mouse prophase, metaphase I and II-staged oocytes. These fundamental techniques allow for the study of chromatin-bound proteins and chromosome morphology throughout mammalian oogenesis.

الكروماتين انتشار الأعمال التحضيرية لتحليل تطور البويضات الماوس من الطور الأول الطورية الثاني

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Genetics

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

استخدام الماوس بويضات لتقييم وظيفة الجينات البشرية أثناء الانقسام الاختزالي أنا

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted reproduction also allows for the production of embryos from high performers without interrupting their sports career and contributes to an increase in the number of foals from mares of high genetic value. The present manuscript describes the procedures used for collecting immature and mature oocytes from horse ovaries using ovum pick-up (OPU). These oocytes were then used to investigate the incidence of aneuploidy by adapting a protocol previously developed in mice. Specifically, the chromosomes and the centromeres of metaphase II (MII) oocytes were fluorescently labeled and counted on sequential focal plans after confocal laser microscope scanning. This analysis revealed a higher incidence in the aneuploidy rate when immature oocytes were collected from the follicles and matured in vitro compared to in vivo. Immunostaining for tubulin and the acetylated form of histone four at specific lysine residues also revealed differences in the morphology of the meiotic spindle and in the global pattern of histone acetylation. Finally, the expression of mRNAs coding for histone deacetylases (HDACs) and acetyl-transferases (HATs) was investigated by reverse transcription and quantitative-PCR (q-PCR). No differences in the relative expression of transcripts were observed between in vitro and in vivo matured oocytes. In agreement with a general silencing of the transcriptional activity during oocyte maturation, the analysis of the total transcript amount can only reveal mRNA stability or degradation. Therefore, these findings indicate that other translational and post-translational regulations might be affected.
Overall, the present study describes an experimental approach to morphologically and biochemically characterize the horse oocyte, a cell type that is extremely challenging to study due to low sample availability. However, it can expand our knowledge on the reproductive biology and infertility in monovulatory species.

This manuscript describes an experimental approach to morphologically and biochemically characterize horse oocytes. Specifically, the present work illustrates how to collect immature and mature horse oocytes by ultrasound-guided ovum pick-up (OPU) and how to investigate chromosome segregation, spindle morphology, global histone acetylation, and mRNA expression.

تحليل فصل الكروموسوم، هيستون أستيلاتيون، و مورفولوجيا المغزل في البويضات الحصان

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted ...

A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus improving the overall pregnancy outcome. We recently developed a classification method based on microscopic live observations of mouse oocytes during their in vitro maturation from the germinal vesicle (GV) to the metaphase II stage, followed by the analysis of the cytoplasmic movements occurring during this time-lapse period. Here, we present detailed protocols of this procedure. Oocytes are isolated from fully-grown antral follicles and cultured for 15 h inside a microscope equipped for time-lapse analysis at 37 &#176;C and 5% CO2. Pictures are taken at 8 min intervals. The images are analyzed using the Particle Image Velocimetry (PIV) method that calculates, for each oocyte, the profile of Cytoplasmic Movement Velocities (CMVs) occurring throughout the culture period. Finally, the CMVs of each single oocyte are fed through a mathematical classification tool (Feed-forward Artificial Neural Network, FANN), which predicts the probability of a gamete to be developmentally competent or incompetent with an accuracy of 91.03%. This protocol, set up for the mouse, could now be tested on oocytes of other species, including humans.

Here, we present a protocol for non-invasive assessment of oocyte developmental competence performed during their in vitro maturation from the germinal vesicle to the metaphase II stage. This method combines time-lapse imaging with particle image velocimetry (PIV) and neural network analyses.

تعريف العصبية المستندة إلى شبكة الاتصال من بويضات شجيرة الماوس تنمويا المختصة أو غير كفء

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

زراعة أنسجة المبيض تصور الظواهر في المبيض الماوس

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Multi-Photon Laser Ablation of Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes

The fidelity of oocyte meiosis is critical for generating developmentally competent euploid eggs. In mammals, the oocyte undergoes a lengthy arrest at prophase I of the first meiotic division. After puberty and upon meiotic resumption, the nuclear membrane disassembles (nuclear envelope breakdown), and the spindle is assembled mainly at the oocyte center. Initial central spindle positioning is essential to protect against abnormal kinetochore-microtubule (MT) attachments and aneuploidy. The centrally positioned spindle migrates in a time-sensitive manner toward the cortex, and this is a necessary process to extrude a tiny polar body. In mitotic cells, spindle positioning relies on the interaction between centrosome-mediated astral MTs and the cell cortex. On the contrary, mouse oocytes lack classic centrosomes and, instead, contain numerous acentriolar MT organizing centers (MTOCs). At the metaphase I stage, mouse oocytes have two different sets of MTOCs: (1) MTOCs that are clustered and sorted to assemble spindle poles (polar MTOCs), and (2) metaphase cytoplasmic MTOCs (mcMTOCs) that remain in the cytoplasm and do not contribute directly to spindle formation but play a crucial role in regulating spindle positioning and timely spindle migration. Here, a multi-photon laser ablation method is described to selectively deplete endogenously labeled mcMTOCs in oocytes collected from Cep192-eGfp reporter mice. This method contributes to the understanding of the molecular mechanisms underlying spindle positioning and migration in mammalian oocytes.

An optimized protocol is presented that enables the depletion of cytoplasmic microtubule organizing centers in mouse oocytes during metaphase I using a near-infrared femtosecond laser.

الاجتثاث بالليزر متعدد الفوتون لمراكز تنظيم الأنابيب الدقيقة السيتوبلازمية في بويضات الفأر

The fidelity of oocyte meiosis is critical for generating developmentally competent euploid eggs. In mammals, the oocyte undergoes a lengthy arrest at ...

تحديد تلف الحمض النووي في البويضات الموقوفة في الطور الأولي للفئران

Detection of DNA Double-Stranded Breaks in Mouse Oocytes

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain arrested at the prophase of meiosis I. The quiescent state may last for years until the oocytes receive a stimulus to grow and obtain the competency to resume meiosis. This protracted state of arrest makes them extremely susceptible to accumulating DNA-damaging insults, which affect the genetic integrity of the female gametes and, therefore, the genetic integrity of the future embryo. 
Consequently, the development of an accurate method to detect DNA damage, which is the first step for the establishment of DNA damage response mechanisms, is of vital importance. This paper describes a common protocol to test the presence and progress of DNA damage in prophase-arrested oocytes during a period of 20 h. Specifically, we dissect mouse ovaries, retrieve the cumulus-oocyte complexes (COCs), remove the cumulus cells from the COCs, and culture the oocytes in &#924;2 medium containing 3-isobutyl-1-methylxanthine to maintain the state of arrest. Thereafter, the oocytes are treated with the cytotoxic, antineoplasmic drug, etoposide, to engender double-strand breaks (DSBs). 
By using immunofluorescence and confocal microscopy, we detect and quantify the levels of the core protein &#947;H2AX, which is the phosphorylated form of the histone H2AX. H2AX becomes phosphorylated at the sites of DSBs after DNA damage. The inability to restore DNA integrity following DNA damage in oocytes can lead to infertility, birth defects, and increased rates of spontaneous abortions. Therefore, the understanding of DNA damage response mechanisms and, at the same time, the establishment of an intact method for studying these mechanisms are essential for reproductive biology research.

تسليط الضوء على المؤلف: فهم استجابة تلف الحمض النووي في بويضات الثدييات والأجنة قبل الزرع 

Maintaining oocyte genome integrity is necessary to ensure the genetic fidelity in the resulting embryo. Here, we present an accurate protocol for detecting DNA double-strand breaks in mammalian female germ cells.

الكشف عن فواصل الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل في بويضات الفئران

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

الماوس Microinjection سيت ، والنضج وتقييم الصيغة الصبغية

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

عزل وتوصيف ماوس الغارية البويضات واستنادا إلى منظمة ونين نويي

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

الكروماتين انتشار الأعمال التحضيرية لتحليل تطور البويضات الماوس من الطور الأول الطورية الثاني

استخدام الماوس بويضات لتقييم وظيفة الجينات البشرية أثناء الانقسام الاختزالي أنا

تحليل فصل الكروموسوم، هيستون أستيلاتيون، و مورفولوجيا المغزل في البويضات الحصان

تعريف العصبية المستندة إلى شبكة الاتصال من بويضات شجيرة الماوس تنمويا المختصة أو غير كفء

زراعة أنسجة المبيض تصور الظواهر في المبيض الماوس

الاجتثاث بالليزر متعدد الفوتون لمراكز تنظيم الأنابيب الدقيقة السيتوبلازمية في بويضات الفأر

الكشف عن فواصل الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل في بويضات الفئران

الكشف عن فواصل الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل في بويضات الفئران

الكشف عن فواصل الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل في بويضات الفئران

الماوس Microinjection سيت ، والنضج وتقييم الصيغة الصبغية