Name: silencing of brca2 to identify novel brca2-regulated biological functions in cultured human cells
Uploaded: 2015-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells at JoVE.com

This work was supported by FIRB-Merit grants RBNE08YFN3_005 and RBNE08HWLZ_012, and the Italian Ministry of Economy and Finance to the CNR for the Project &#8220;FaReBio di Qualit&#224;&#8221;.

1. إعداد الحلول سيرنا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و resuspend 5 نانومول من مخلوط (السيطرة) و 5 نانومول من BRCA2 سيرنا الكريات المجففة في 100 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه (تركيز سيرنا النهائي: 50 ميكرومتر). هذا هو مخزون سيرنا ويجب تخزينها في -20 درجة مئوية في 10 مكل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ قسامة من 10 ميكرولتر من الأسهم سيرنا وإضافة 40 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه للحصول على حل العاملة 10 ميكرومتر سيرنا. يجب أن يتم تخزين هذا التخفيف في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. ملاحظة: الحل العمل سيرنا لا ينبغي أن تخضع لتجميد / الذوبان أكثر من 3 مرات. </li></ol> 2. البذر من الظهارية الإنسان خطوط الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة النمو من خطوط الخلايا الظهارية الإنسان متنامية مع الطبقات الوحيدة الخلية في لوحات زراعة الأنسجة في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا في لوحة واحدة مع RT PBS (10 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 100 ملم لوحة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفصل الخلايا من لوحة،إضافة 2 مل من 0.25٪ التربسين / 0.53 ملي EDTA الحل واحتضان 3-5 دقائق اعتمادا على نوع من الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل جمع خلايا منفصلة، ​​تحييد التربسين بإضافة 2 مل من وسط النمو تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا في 320-330 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية في الدوار الدلو المتأرجح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend وكريات خلية في 5 مل من المضادات الحيوية مجانا المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا تحت المجهر في غرفة Burker أو باستخدام نظام العد الآلي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور الخلايا في 6 لوحات جيدا لتكون حوالي 80٪ متموجة بعد 24 ساعة (0.5-1 X10 6 الخلايا في 2 مل من المتوسط ​​لكل بئر). عدد الخلايا الأمثل ليكون المصنف قد تختلف اعتمادا على خطوط معينة من الخلايا ومعدل النمو. ملاحظة: لا تقم بإضافة المضادات الحيوية على المدى المتوسط ​​عند هذه النقطة لأن المضادات الحيوية سوف تتداخل سلبيا مع كفاءة حوالةction. من المهم جدا أن الخلايا هي في الممرات ثقافة منخفضة (&lt;10) لتحقيق كفاءة عالية من BRCA2 سيرنا ترنسفكأيشن. </li></ol> 3. خلايا Transfect مع سيرنا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أربع وعشرين ساعة طلاء الخلايا، المضي قدما في الجولة الأولى من ترنسفكأيشن. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع 6 ميكرولتر من الدهون على أساس 10 سيرنا كاشف ترنسفكأيشن محدد في 130 ميكرولتر من انخفاض متوسط ​​المصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع 3 ميكرولتر من 10 ميكرومتر سيرنا (30 بمول) في 130 ميكرولتر من انخفاض متوسط ​​المصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين سيرنا المخفف مع كاشف ترنسفكأيشن المخفف واحتضان لمدة 5-10 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء الحضانة، وإزالة المتوسطة من الخلايا وإضافة 2 مل من متوسطة جديدة قبل تحسنت عند 37 درجة مئوية (من دون مضادات حيوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 250 ميكرولتر من المجمعات كاشف سيرنا ترنسفكأيشن إلى الخلايا (هذا المبلغ هو بئر واحدة من لوحة 6 أيضا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا في حاضنة ترطيب عند 3776؛ C مع 5٪ CO 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة، المضي قدما في الدور الثاني من ترنسفكأيشن بتكرار الخطوات 3.1.1-3.1.5 مع التعديلات التالية لخطوة 3.1.2: تمييع 5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر سيرنا (50 بمول) في 130 ميكرولتر من انخفاض متوسط ​​المصل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لمدة 1-2 أيام عند 37 درجة مئوية قبل التحليل. ملاحظة: جولتان من transfections واستخدام نسبة عالية كاشف سيرنا / ترنسفكأيشن في الجولة الثانية ضرورية للحصول على كفاءة عالية من BRCA2 إسكات. </li></ol></li></ol> 4. الخلايا ليز لتحليل immunoblotting <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العازلة تحلل جديدة مع برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) تحتوي على 1٪ من غير أيوني، غير تغيير طبيعة المنظفات octylphenoxypolyethoxyethanol، 5 ملي بيروفسفات الصوديوم، 1 ملم orthovanadate الصوديوم، و 10 ملي فلوريد الصوديوم، 2 مم phenylmethylsulfonyl الفلوريد، 10 ميكروغرام / مل leupeptin، 10 ميكروغرام / مل أبروتينين. يبقيه على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة متوسطة من الخلايا وثرماد لهم مرة واحدة مع PBS الباردة (2 مل / جيد) في لوحة. لمنع أي المرحل PBS، إزالة ذلك من لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من تحلل العازلة على كل جانب. ملاحظة: إذا كانت الخلايا يجب أن تستخدم أيضا لفحوصات أخرى، يعرض للتريبسين الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2،1-2،6 وresuspend الخلايا غير مناسب العازلة / متوسطة وفقا للتطبيق لاستخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تناوب بلطف لوحة لتوزيع موحد للتحلل العازلة واحتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية على محور دوار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع المحللة خلية في أنبوب microcentrifuge على الجليد باستخدام مكشطة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 17900 x ج لمدة 25 دقيقة في 4 درجات مئوية وجمع طاف في أنبوب جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس تركيز البروتين باستخدام فحص البروتين المتاحة تجاريا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li></ol> تحليل immunoblotting 5. BRCA2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المخزن المؤقت تشغيل عن طريق تمييع 50 مل من 20X تريس، خلات SDS تشغيل بuffer (50 ملي Tricine، 50 ملي تريس قاعدة، 0.1٪ SDS، ودرجة الحموضة 8.24) مع 950 مل من الماء المقطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير العينة على النحو التالي: إضافة 15 ميكروغرام من إجمالي المحللة الخلية، 5 ميكرولتر من 4X عينة العازلة التي تحتوي على ليثيوم دوديسيل كبريتات في الرقم الهيدروجيني 8.4، 2 ميكرولتر من 10X عينة الحد من وكيل (0.5 M DTT)، وتحلل العازلة إلى الحجم النهائي من 20 ميكرولتر. ملاحظة: يسمح هذا البروتوكول الكشف عن BRCA2 في خطوط الخلايا العادية أيضا عند استخدام كمية أقل من البروتين الكلي (وصولا الى 5 ميكروغرام). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفسد العينات عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. ملاحظة: ومن الأهمية بمكان استخدام 55 ° C. منذ البروتين BRCA2 هو حساس للحرارة 11 ودرجات الحرارة أعلى تغيير طبيعة يسبب خسارة ثابتة للسليما كامل طول (390 كيلو دالتون) البروتين BRCA2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد غرفة الكهربي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل العينات و 10 ميكرولتر من ارتفاع الوزن الجزيئي قبل الملطخة البروتين القياسية على هلام precasted (تريس، خلات 3-8٪) وتعمل في 120 V لABخارج 2 ساعة 12. إيقاف تشغيل الكهربي قبل يترك 55 كيلو دالتون علامة زرقاء هلام precasted. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المخزن المؤقت نقل مع 50 مل من 20x ونقل العازلة، 100 مل من الميثانول بنسبة 100٪ و 850 مل من الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنشيط الغشاء PVDF (0.45 ميكرون حجم المسام) عن طريق نقع في الميثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 دقائق ثم يشطف بالماء المقطر وتتوازن في المخزن نقل على الأقل لمدة 5 دقائق. نقع الإسفنج لجهاز نقل في المخزن نقل في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما المدى الكهربي هو أكثر، وتجميع شطيرة في كومة نقل بالترتيب التالي (من أسفل إلى أعلى): ثلاثة الإسفنج مشبعة في المخزن نقل، 3MM واحد ورقة ورقة الصف المشبعة في المخزن نقل، وهلام، غشاء PVDF تفعيلها، واحدة 3MM ورقة ورقة الصف المشبعة في المخزن نقل، ثلاثة الإسفنج مشبعة في نقل العازلة 13،14. وضع كومة في جهاز ونقل البروتينات في 350 مللي أمبير لمدة 4 ساعة عند 4 درجات مئوية أو 180 مللي أمبير بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. ملاحظة: يجري BRCA2 بروتين كبير جدا، لا بد من تمديد الوقت نقل من 1 ساعة (كما اقترح من قبل الشركة المصنعة ومعظم بروتوكولات نقل) إلى 4 ساعات أو طوال الليل لضمان نقل كامل من البروتينات عالية الوزن الجزيئي. وبالإضافة إلى ذلك، ويرجع ذلك إلى وقت طويل نقل، فمن الضروري لأداء النشاف في غرفة باردة في 4 درجات مئوية للحد من ارتفاع درجة الحرارة وتسهيل تفكيك شطيرة. أنظمة نقل شبه الجافة ليست جيدة لنقل البروتينات الكبيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد نقل، ويغسل الغشاء مع TBS، منعه لمدة 1 ساعة على RT في TBS-توين 0.25٪ (TBS-T) التي تحتوي على 5٪ غير دهن الحليب الجاف والتحقيق بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع 30 ميكرولتر مكافحة BRCA2 الأرنب بولكلونل الأجسام المضادة ( 200 ميكروغرام / مل)، مخففة في 9 مل TBS-T + 5٪ غير دهن الحليب الجاف [1: 300 (V / V) التخفيف]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل الغشاء ثلاث مرات (10 دقيقة لكل منهما) مع TBS-T، ثم احتضان مرشح لمدة 1 ساعة مع 1 ميكرولتر من الفجل-البيروكسيديز مترافق المضادة للأرنب الضد الثانوية مخففة في 10 مل من TBS-T + 5٪ غير دهن الحليب الجاف. بعد ذلك، ويغسل الغشاء ثلاث مرات (10 دقيقة لكل منهما) مع TBS-T. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء مناعي من قبل ECL للكشف عن البروتين BRCA2 باستخدام تعزيز التوهج (ECL) الغربية التنشيف كشف الكاشف، باتباع إرشادات الشركة المصنعة. تصور العصابات immunochemiluminescent على ارتفاع القرار الأفلام ECL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء مناعي مع الأجسام المضادة للجين التدبير المنزلي، مثل β تويولين (55 كيلو دالتون)، على مرشح واحد عن السيطرة التحميل باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة إلى β تويولين المخفف في 1: 1000 (10 ميكرولتر من الأجسام المضادة لمكافحة تويولين في 10 مل TBS-T + 5٪ الحليب المجفف منزوع الدسم) لمدة 1 ساعة على RT. غسل واحتضان الضد الثانوية كما هو موضح BRCA2 (5،10-5،11)، باستثناء استخدام الفجل-البيروكسيديز مترافق مكافحة الفأر بدلا من المضادة للأرنب الضد الثانوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صورة رقمية للأفلام أعجب مع عصابات immunochemiluminescent وتحليل كثافة الفرقة التي كتبها صورة مخصصة برامج التحليل (على سبيل المثال.، يماغيج). </li></ol>

<ol>
	<li>Thorslund, T., West, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA2:+a+universal+recombinase+regulator.">BRCA2: a universal recombinase regulator.</a> Oncogene. 26, 7720-7730 (2007).</li><li>Yoshida, K., Miki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+BRCA1+and+BRCA2+as+regulators+of+DNA+repair,+transcription,+and+cell+cycle+in+response+to+DNA+damage.">Role of BRCA1 and BRCA2 as regulators of DNA repair, transcription, and cell cycle in response to DNA damage.</a> Cancer Sci. 95, 866-871 (2004).</li><li>Martin, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+mutations+in+BRCA1+and+BRCA2+in+breast-ovarian+families+from+a+breast+cancer+risk+evaluation+clinic.">Germline mutations in BRCA1 and BRCA2 in breast-ovarian families from a breast cancer risk evaluation clinic.</a> J Clin Oncol. 19, 2247-2253 (2001).</li><li>Castro, E., Eeles, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+BRCA1+and+BRCA2+in+prostate+cancer.">The role of BRCA1 and BRCA2 in prostate cancer.</a> Asian J Androl. 14, 409-414 (2012).</li><li>Vencken, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensitivity+and+outcome+of+BRCA1-+and+BRCA2-associated+ovarian+cancer+patients+after+first-line+chemotherapy+compared+with+sporadic+ovarian+cancer+patients.">Chemosensitivity and outcome of BRCA1- and BRCA2-associated ovarian cancer patients after first-line chemotherapy compared with sporadic ovarian cancer patients.</a> Ann Oncol. 22, 1346-1352 (2011).</li><li>Farmer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+DNA+repair+defect+in+BRCA+mutant+cells+as+a+therapeutic+strategy.">Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy.</a> Nature. 434, 917-921 (2005).</li><li>Arbini, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+depletion+sensitizes+cancer+cells+to+PARP+inhibitors+by+translational+and+post-translational+repression+of+BRCA2.">Mitochondrial DNA depletion sensitizes cancer cells to PARP inhibitors by translational and post-translational repression of BRCA2.</a> Oncogenesis. 2, e82 (2013).</li><li>Yang, F., Guo, X., Yang, G., Rosen, D. G., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AURKA+and+BRCA2+expression+highly+correlate+with+prognosis+of+endometrioid+ovarian+carcinoma.">AURKA and BRCA2 expression highly correlate with prognosis of endometrioid ovarian carcinoma.</a> Mod Pathol. 24, 836-845 (2011).</li><li>Guaragnella, N., Marra, E., Galli, A., Moro, L., Giannattasio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+BRCA2+decreases+anoikis+and+its+heterologous+expression+sensitizes+yeast+cells+to+acetic+acid-induced+programmed+cell+death.">Silencing of BRCA2 decreases anoikis and its heterologous expression sensitizes yeast cells to acetic acid-induced programmed cell death.</a> Apoptosis. 19, 1330-1341 (2014).</li><li>Mahato, R. I., Rolland, A., Tomlinson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid-based+gene+delivery+systems:+pharmaceutical+perspectives.">Cationic lipid-based gene delivery systems: pharmaceutical perspectives.</a> Pharm Res. 14, 853-859 (1997).</li><li>Su, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+BRCA2:+temperature+sensitivity+of+detection+and+cell-cycle+regulated+expression.">Characterization of BRCA2: temperature sensitivity of detection and cell-cycle regulated expression.</a> Oncogene. 17, 2377-2381 (1998).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>Burnette, W. N. '. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Western+blotting':+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">'Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).</li><li>Hunter, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+targeting+of+hypoxia+and+homologous+recombination+repair+dysfunction+in+triple-negative+breast+cancer.">Dual targeting of hypoxia and homologous recombination repair dysfunction in triple-negative breast cancer.</a> Mol Cancer Ther. , (2014).</li><li>Drew, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+poly(ADP-ribose)+polymerase+inhibitor+AG014699+in+human+cancers+with+mutated+or+methylated+BRCA1+or+BRCA2.">Therapeutic potential of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor AG014699 in human cancers with mutated or methylated BRCA1 or BRCA2.</a> J Natl Cancer Inst. 103, 334-346 (2011).</li><li>Bryant, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+killing+of+BRCA2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly(ADP-ribose)+polymerase.">Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase.</a> Nature. 434, 913-917 (2005).</li><li>Ihnen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+the+poly(ADP-ribose)+polymerase+inhibitor+rucaparib+for+the+treatment+of+sporadic+human+ovarian+cancer.">Therapeutic potential of the poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor rucaparib for the treatment of sporadic human ovarian cancer.</a> Mol Cancer Ther. 12, 1002-1015 (2013).</li><li>Jeong, J. H., Jo, A., Park, P., Lee, H., Lee, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brca2+Deficiency+Leads+to+T+Cell+Loss+and+Immune+Dysfunction.">Brca2 Deficiency Leads to T Cell Loss and Immune Dysfunction.</a> Mol Cells. , (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

بسبب الطفرات سلالة الجرثومية من الرصاص BRCA2 الجينات إلى زيادة خطر عدة أنواع من السرطان، بما في ذلك الذكور والإناث سرطان الثدي وسرطان المبيض وسرطان البروستاتا، وسرطان البنكرياس، وسرطان الجلد 3،4، وقد أجريت العديد من الدراسات لفهم الوظيفة البيولوجية من البروتين BRCA2. معظم هذه الدراسات أساسا تستند الجينية بسبب الصعوبات التقنية في تحليل البروتين العملاقة مثل BRCA2. الطريقة الموضحة هنا لإسكات وتحليل البروتين BRCA2 التعبير يوفر أداة فعالة لتحقيق وظائف الورم BRCA2 القامع الجينات في طيف واسع من المقايسات البيولوجية. ويستند البروتوكول إسكات بشأن الإجراءات ترنسفكأيشن سيرنا القياسية بعد يحتوي على العديد من التعديلات الهامة وكذلك نصائح لضربة قاضية ناجحة وثابتة من BRCA2. بروتوكول ترنسفكأيشن سيرنا آمن وسريع وفعال وبطريقة مختلفة عن shRNA، الأمر الذي يجعل عادة استخدام يونناقلات tiviral، لا تحتاج إجراءات محددة للسلامة الأحيائية، ويمكن أن يؤديها بسهولة في أي مختبر مجهز منشأة ثقافة الخلية. وبالمثل، فقد تم تحسين بروتوكول immunoblotting للكشف الفعال للبروتين كبير مثل BRCA2. تم التحقق من صحة بروتوكول immunoblotting أيضا للكشف عن المؤتلف البروتين البشري BRCA2 أعرب heterologously في خلايا الخميرة 9. وذكرت عدة عوامل هامة للتسليم الفعال للسيرنا هنا. وهي تشمل دورتين من transfections وسيرنا ارتفاع نسبة ترنسفكأيشن الكاشف ل، وخاصة في المرحلة الثانية. غياب بالمضادات الحيوية قبل وأثناء إجراء ترنسفكأيشن هو عامل حاسم آخر. ومع ذلك، هذا الإجراء يعرض الخلايا في الثقافة إلى زيادة خطر التلوث البكتيري. وبالتالي ينبغي اتخاذ احتياطات اضافية لضمان مستوى عال من العقم في جميع الخطوات. وتجدر الإشارة إلى أنه، اعتمادا على نوع من الخلايا، knockdo الجين الفعالسفل سوف تتطلب عادة 24-48 ساعة بعد الدورة الثانية. الأسلوب الحالي لديه ميزة حفظ الجينات إسكات مستقرة تماما على الأقل حتى يوم 7 بعد دورة ترنسفكأيشن الثانية. وهذا يسمح للدراسة آثار BRCA2 ضربة قاضية في مجموعة متنوعة من المقايسات البيولوجية، بما في ذلك الاستجابة الخلوية للأدوية العلاج الكيميائي مختلفة. ومع ذلك، يتم تمثيل الحد من التقنية الحالية من خلال حقيقة أن جزيئات سيرنا الخارجية لم تدرج في الجينوم، لا يمكن أن يتحقق ضربة قاضية بذلك مستقرة في التعبير الجيني. بدلا من ذلك، للحصول على ضربة قاضية مستقرة، shRNA عدوى lentiviral يمكن القيام بها، شريطة أن يتم إعداد المختبر لمتطلبات السلامة الأحيائية إضافية (BSL 2 المعايير وفقا للمبادئ التوجيهية NIH). بالإضافة إلى ذلك، عندما ترنسفكأيشن ليس نهجا ينطبق على دراسة وظيفة الجين في نوع خلية معينة (على سبيل المثال، الخلايا اللمفية تي)، واستخدام الفئران المشروط BRCA2 خروج المغلوب خلية محددة يبقى altern الوحيدative 19. طريقة هذه التقارير أيضا العديد من النصائح للكشف الناجح لنسبة عالية من البروتين الجزيئي الوزن عن طريق immunoblotting وأنه من المناسب لكل من البروتينات العالية والمنخفضة وفرة. على وجه الخصوص، نظرا لthermosensitivity من البروتين BRCA2، ودرجة حرارة أقل تغيير طبيعة أمر بالغ الأهمية للكشف عن الأمثل، وذلك بالاتفاق مع دراسة سابقة 11. هذا &#39;خدعة&#39; التقنية قد تكون مفيدة للبروتينات الأخرى التي الكشف عن طريق بروتوكولات immunoblotting القياسية وقد ثبت ناجحة أيضا. نحن نتوقع أن هذا الأسلوب يتضمن نصائح للصحة العامة، وبالتالي قد يسهل إسكات والكشف عن العديد من البروتينات تحدي الأخرى.

بترميز الجين BRCA2 (سرطان الثدي قابلية الجينات 2) لبروتين القامع الورم الذي يلعب دورا حاسما في إصلاح DNA فواصل مزدوج الجديلة من خلال تنظيم وظيفة الانزيم recombinase Rad51 1. كما تم المتورطين BRCA2 في التشكيل النسخ والسيطرة في الخلية دورة 2. الطفرات سلالة الجرثومية في الجين BRCA2 تحفز الحساسية جسمية مهيمنة لسرطان الثدي وسرطان المبيض لدى النساء وسرطان البروستاتا لدى الرجال، فضلا عن الاستعداد لأنواع السرطان الأخرى 3،4. ومع ذلك، على الرغم من زيادة خطر في الاصابة بسرطان، والطفرات BRCA2 التي تقمع أو الحد من وظيفة BRCA2 قد تجعل الخلايا السرطانية أكثر عرضة لعوامل العلاج الكيميائي الذي يسبب التلف في الحمض النووي 07/05. السرطان متفرقة يحمل انخفاض معدل الطفرات BRCA2 (&lt;3٪) على الرغم من انخفاض مستويات البروتين BRCA2 قد تم الكشف عنها في بعض أنواع السرطان، مما يشير إلى أن البروتين BRCA2قد يتم فقدان أثناء تكون الأورام في أمراض السرطان متفرقة خلال آليات غير طفري ​​التي تعتمد على 7،8. وبالتالي، فمن المهم أن نفهم بشكل كامل وظائف BRCA2 في سياق بيولوجيا السرطان وكذلك في إعدادات البيولوجية الأخرى. أداة قوية تستخدم لتحديد وظائف جديدة من الجينات في خلايا الثدييات هي لإسكات تعبيرها. وكمثال على ذلك، فقد أدت إسكات التعبير BRCA2 في مجموعة متنوعة من الخلايا الظهارية الطبيعية مؤخرا إلى تحديد وظيفة جديدة للBRCA2 كمنظم للمقاومة anoikis، خطوة هامة خلال الاستحواذ على الخلايا السرطانية الغازية والمتنقل قدرة 9. لا يمكن أن يتحقق الجينات إسكات عن طريق إدخال في الخلايا إما صغير التدخل (سي) RNA أو دبوس الشعر القصير (ش) جزيئات الحمض النووي الريبي استهداف جين معين. رجولية عالية من سيرنا وسهولة الاستخدام جعله أداة تفضيلية لإسكات التجارب التي تهدف إلى اكتساب رؤى جديدة في العمليات البيولوجية الهامة لالثانية لتحديد أهداف علاجية جديدة. ومع ذلك، ضربة قاضية كفاءة في التعبير الجيني قد لا تكون قابلة للتحقيق بسهولة لجميع الجينات وربما يكون متغير بدرجة كبيرة اعتمادا على نوع من الخلايا. بسبب انخفاض في مستويات البروتين داخل الخلايا هو النمط الظاهري الأكثر ملاءمة قيد التحقيق، لا بد من تحديد إسكات الجينات التي immunoblotting تحليل للمنتج الجين. مع هذا الصدد، يقدم البروتين BRCA2 تحديا آخر: كونه بروتين كبير (حوالي 390 كيلو دالتون)، والصعوبات التقنية موجودة لتحليل الكيمياء الحيوية التقليدية، بما في ذلك immunoblotting. نحن هنا التقرير بروتوكول الأمثل لإسكات الفعال للBRCA2 في خطوط الخلايا الظهارية الإنسان وللكشف السريع والناجح من البروتين BRCA2 ضربة قاضية من قبل immunoblotting التحليل.

<table><tbody><tr><td>BRCA2 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-003462-00</td><td>SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA</td></tr><tr><td>Ctrl siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>&amp;nbsp;D-001810-10-05</td><td>ON-TARGETplus Non-targeting Pool</td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX Reagent&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/13778075&quot;&gt;13778075&lt;/a&gt;</td><td>Transfection Reagent</td></tr><tr><td>OPTI-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td>Medium for transfection procedure</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 mm Gel precast</td><td>Life Technologies</td><td>EA0378</td><td>Gel for protein electrophoresis</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample buffer&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td>Reagent for protein electrophoresis</td></tr><tr><td>NuPAGE Sample Reducing agent (10x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0004</td><td>Reagent for protein electrophoresis</td></tr><tr><td>NuPAGE Antioxidant</td><td>Life Technologies</td><td>NP0005</td><td>Reagent for protein electrophoresis</td></tr><tr><td>HiMark Pre-stained protein standard</td><td>Life Technologies</td><td>LC5699</td><td>Prestained marker for gel electrophoresis</td></tr><tr><td>XCell SureLoc Mini-Cell&amp;nbsp; System</td><td>Life Technologies</td><td>EI0002</td><td>Equipment for protein electrophoresis/transfer</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>LA0041</td><td>Reagent for Western blotting</td></tr><tr><td>PVDF membrane</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Reagent for Western blotting</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>NP0006-1</td><td>Reagent for Western blotting</td></tr><tr><td>BRCA2 H-300 rabbit polyclonal antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8326</td><td>1:300 dilution</td></tr><tr><td>Beta-tubulin monoclonal antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4026-100UL</td><td>1:1,000 dilution</td></tr><tr><td>Skim Milk powder</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70166</td><td>Reagent for Western blotting</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td>Reagent for Western blotting</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico/Femto Chemiluminescent Substrate</td><td>Pierce Thermo Scientific</td><td>34080/34096</td><td>Chemiluminescence system</td></tr><tr><td>PNT1A cells</td><td>SIGMA Aldrich (for ECACC)</td><td>95012614</td><td>PNT1A human, normal prostate epithelium immortalized with SV40</td></tr><tr><td>Nthy cells</td><td>SIGMA Aldrich (for ECACC)</td><td>90011609</td><td>Nthy-ori 3-1 Cell Line human, thyroid follicular epithelial cells</td></tr><tr><td>Cell Proliferation Kit I (MTT)</td><td>Roche</td><td>11465007001</td><td>Kit for cell proliferation assays</td></tr></tbody></table>

silencing of brca2 to identify novel brca2-regulated biological functions in cultured human cells

إسكات الكابتة للورم البروتين BRCA2 وكشف من خلال التحليلات الكيميائية الحيوية التقليدية تمثل تحديا تقنيا كبيرا نظرا لحجم كبير من البروتين البشري BRCA2 (حوالي 390 كيلو دالتون). نفيدكم التعديلات ترنسفكأيشن وimmunoblotting بروتوكولات سيرنا القياسية لإسكات BRCA2 البشري وكشف الذاتية البروتين BRCA2، على التوالي، في خطوط الخلايا الظهارية الإنسان. وتشمل الخطوات الرئيسية لسيرنا ارتفاع نسبة ترنسفكأيشن الكاشف لواثنين من الجولات اللاحقة من سيرنا ترنسفكأيشن داخل نفس التجربة. باستخدام هذه وغيرها من التعديلات على بروتوكول قياسي نحن باستمرار تحقيق أكثر من 70٪ إسكات الجينات BRCA2 البشري كما تقرره immunoblotting التحليل مع أضداد BRCA2. بالإضافة إلى ذلك، تمسخ من الخلية لست] في 55 ° C بدلا من التقليدية 70-100 ° C والتحسينات التقنية الأخرى من الإجراء immunoblotting السماح الكشف عن البروتين BRCA2 سليمة حتى WHأون كميات قليلة جدا من بدء المواد المتاحة أو عندما تكون مستويات بروتين تعبير BRCA2 منخفضة جدا. إسكات الفعال للBRCA2 في الخلايا البشرية يقدم استراتيجية ثمينة لتعطيل وظيفة BRCA2 في الخلايا مع BRCA2 سليمة، بما في ذلك الخلايا السرطانية، لدراسة المسارات الجزيئية الجديدة والوظائف الخلوية التي قد تتأثر طفرات BRCA2 المسببة للأمراض في الأورام. وينبغي أن يكون التكيف هذا البروتوكول لإسكات وتحليل البروتينات الأخرى كبيرة &quot;مثل BRCA2 كفاءة تحقيقه بسهولة.

قبل الشروع في / الفحص البيولوجي والكيمياء الحيوية لدراسة تأثير BRCA2 إسكات على وظائف الخلية، فإن الخطوة الأولى هي لتأكيد خصوصية إسكات باستخدام سيرنا المخفوق (عدم استهداف سيرنا) جنبا إلى جنب مع BRCA2 سيرنا (الشكل 1A ). من المهم إجراء الجولة الثانية من سيرنا ترنسفكأيشن مع نسبة عالية سيرنا / ترنسفكأيشن للحصول على كفاءة عالية من BRCA2 إسكات. في الواقع، وأداء جولة واحدة فقط من سيرنا ترنسفكأيشن أو باستخدام سيرنا أدنى لنسبة ترنسفكأيشن في الجولة الثانية (25 بمول سيرنا و 6 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن) من شأنه أن يؤدي إلى انخفاض كفاءة ضربة قاضية (الشكل 1B). والخطوة الثانية هي لتقييم الحد الأدنى من الوقت الأمثل للحصول على أعلى مستوى من إسكات الجينات. اعتمادا على نوع من الخلايا، و يمكن أن يختلف بين 24 و 48 ساعة بعد الجولة الثانية من سيرنا ترنسفكأيشن. على سبيل المثال، 24 ساعة كافية لخلايا الغدة الدرقية Nthy لكن ما يصل الى 48وهناك حاجة إلى ساعة لكفاءة ضربة قاضية BRCA2 في خلايا البروستاتا PNT1A (الشكل 2A). BRCA2 إسكات غير مستقر تماما حتى يوم 7 بعد دورة ترنسفكأيشن الثانية (الشكل 2B). من المذكرة، وتغيير طبيعة ولست] خلية في درجة الحرارة فوق 55 درجة مئوية (100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق)، والنتائج في ما يصل إلى 50٪ خسارة من البروتين BRCA2 (الشكل 2C)، وذلك بسبب thermosensitivity من BRCA2 11. مرة واحدة يتم تأسيس الوقت الأمثل إسكات، يمكن استغلالها من آثار فقدان البروتين BRCA2 في عدة فحوصات. منذ المجراة الطفرات التي تسبب فقدان وظيفة BRCA2 تشجيع زيادة الحساسية للمثبطات PARP فضلا عن أدوية العلاج الكيميائي الأخرى التي تسبب التلف في الحمض النووي 15-18، مقايسة شيوعا هو لتحديد حساسية الخلايا -silenced BRCA2 إلى rucaparib PARP المانع أو oloparib. في التجربة التي أعلن عنها في الشكل (3)، وخلايا PNT1A المنضب سو BRCA2 البروتين من خلال سيرنا تم التعامل مع 10 ميكرومتر rucaparib لمدة 24 ساعة، وبعد ذلك تم تقييم انتشار الخلايا عن طريق تكاثر الخلايا مقايسة على أساس MTT. استنزاف النتائج البروتين BRCA2 في انخفاض تعتمد على الوقت في تكاثر الخلايا بعد العلاج rucaparib (الشكل 3). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52849/52849fig1.jpg" /> الشكل 1. جولتان من ترنسفكأيشن سيرنا وارتفاع نسبة ترنسفكأيشن الكاشف لتحسين BRCA2 إسكات. (A) خصوصية BRCA2 إسكات وأكد في الخلايا Nthy التي كتبها immunoblotting تحليل 24 ساعة بعد الجولة الثانية من ترنسفكأيشن، وذلك باستخدام سارعت سيرنا (السيطرة)، والسيطرة للمقارنة بين مستويات البروتين BRCA2. وذكرت علامات الوزن الجزيئي على اليسار، وتعرض (B) خلايا PNT1A إلى 1 أو 2 دورات BRCA2 الصورةترنسفكأيشن الجمهورية الاسلامية الايرانية كما هو موضح في البروتوكول [دورات (#) 1 و 2] وكان كميا والبروتين BRCA2 استنزاف من قبل immunoblotting. واستخدمت دورتين من ترنسفكأيشن مع سيرنا سارعت عن التحكم (السيطرة). في 2B، تعرض خلايا PNT1A لدورتين من BRCA2 سيرنا ترنسفكأيشن باستخدام سيرنا انخفاض نسبة ترنسفكأيشن الكاشف لفي الدورة الثانية بمثابة تعديل (25 بمول سيرنا / 6 ميكرولتر كاشف ترنسفكأيشن). في جميع الحالات، تم تحليل مستويات البروتين BRCA2 48 ساعة بعد الدورة الثانية. في الجزء السفلي، وتفيد التقارير الكمي لمستويات البروتين BRCA2 كنسبة BRCA2 / تويولين. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52849/52849fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/52849/52849fig2.jpg" /> الشكل 2. الأمثل من BRCA2 ضربة قاضية. (A) OPTIMقد تتطلب آل BRCA2 ضربة قاضية 24-48 ساعة بعد دورة سيرنا ترنسفكأيشن الثانية. تم تقييم اثنين من خطوط مختلفة من الخلايا (PNT1A وNthy) لBRCA2 ضربة قاضية 24 ساعة و 48 ساعة بعد دورة سيرنا ترنسفكأيشن الثانية immunoblotting التحليل. في الجزء السفلي، يتم الإبلاغ عن مستويات البروتين BRCA2 كنسبة مئوية من مستويات في وقت و0 ساعة، وضعت في تمثل 100. بيانات متوسط ​​± SE من ثلاث تجارب مستقلة. (B) BRCA2 ضربة قاضية مستقرة لمدة 7 أيام. تم تقييم الخلايا PNT1A لBRCA2 ضربة قاضية حتى 196 ساعة بعد دورة ترنسفكأيشن سيرنا الثانية immunoblotting. وتفيد التقارير أن نسبة BRCA2 إلى إشارة تويولين في الأسفل. (C) البروتين BRCA2 هو حساس للحرارة. وقد تم جمع الخلايا PNT1A غير transfected 24 ساعة بعد الطلاء (حوالي 70٪ confluency) وهي lysed وفقا للبروتوكول. تم التشويه والتحريف اثنين قسامات من المحللة خلية نفسه (15 ميكروغرام البروتين الكلي) إما عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة أو 100 &amp; #تم تقييم C لمدة 5 دقائق والبروتين BRCA2 المستويات immunoblotting، 176. في الجزء السفلي، وذكرت نسبة BRCA2 إلى إشارة تويولين. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52849/52849fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52849/52849fig3.jpg" /> الشكل 3. BRCA2 إسكات يزيد من حساسية الخلايا للrucaparib PARP المانع. PNT1A الخلايا إما مع transfected التحكم (السيطرة) أو BRCA2 سيرنا تم جمع 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن ومطلي في 96-جيدا لوحة (خلايا 2000 / جيد). بعد 24 ساعة، تم إضافة 10 ميكرومتر rucaparib إلى الخلايا لمدة 24 ساعة، وبعد ذلك تم الاحتفاظ بها الخلايا في غياب الدواء تصل إلى 96 ساعة. تم تقييم تكاثر الخلايا في الوقت المشار إليه باستخدام فحص MTT عن طريق قياس الامتصاصية في 550-690 نانومتر. EACنقطة و الزمن التقريبي تمثل يعني ± SD من ثلاثة آبار من تجربة تمثيلية. السيطرة سيرنا، الخط الأزرق، BRCA2 سيرنا، خط أحمر. في الجزء العلوي، وذكرت BRCA2 الشخصي البروتين في الخلايا BRCA2 سيرنا transfected. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52849/52849fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells at JoVE.com

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented.

إسكات<em&gt; BRCA2</em&gt; من التعرف على رواية الوظائف البيولوجية التنظيم BRCA2 في الخلايا البشرية المستزرعة

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

silencing-brca2-to-identify-novel-brca2-regulated-biological

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

9.0K Views.  National Research Council. Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented. 

Video: Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery of the next generation of novel drug targets. It is becoming apparent that more complex models of cancer are required to fully appreciate the contributing factors that drive tumorigenesis in vivo and increase the efficacy of novel therapies that make the transition from pre-clinical models to clinical trials.
Here we present a methodology for generating uniform and reproducible tumor spheroids that can be subjected to siRNA functional screening. These spheroids display many characteristics that are found in solid tumors that are not present in traditional two-dimension culture. We show that several commonly used breast cancer cell lines are amenable to this protocol. Furthermore, we provide proof-of-principle data utilizing the breast cancer cell line BT474, confirming their dependency on amplification of the epidermal growth factor receptor HER2 and mutation of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) when grown as tumor spheroids. Finally, we are able to further investigate and confirm the spatial impact of these dependencies using immunohistochemistry.

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

الاستفادة من علم الجينوم وظيفية الفرز لتحديد أهداف المخدرات رواية يحتمل في الثقافات كروي الخلية السرطانية

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Cancer Research

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter assays, embryonic stem cell viability assays, and therapeutic drug-based sensitivity assays. Although they have clarified a lot of BRCA1 variants, these assays involving the use of exogenously expressed BRCA1 variants are associated with overexpression issues and cannot be applied to post-transcriptional regulation. To resolve these limitations, we previously reported a method for functional analysis of BRCA1 variants via CRISPR-mediated cytosine base editor that induce targeted nucleotide substitution in living cells. Using this method, we identified variants whose functions remain ambiguous, including c.-97C&#62;T, c.154C&#62;T, c.3847C&#62;T, c.5056C&#62;T, and c.4986+5G&#62;A, and confirmed that CRISPR-mediated base editors are useful tools for reclassifying the variants of uncertain significance in BRCA1. Here, we describe a protocol for functional analysis of BRCA1 variants using CRISPR-based cytosine base editor. This protocol provides guidelines for the selection of target sites, functional analysis and evaluation of BRCA1 variants.

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

People with BRCA1 mutations have a higher risk of developing cancer, which warrants accurate evaluation of the function of BRCA1 variants. Herein, we described a protocol for functional assessment of BRCA1 variants using CRISPR-mediated cytosine base editors that enable targeted C:G to T:A conversion in living cells.

التقييم الوظيفي لمتغيرات BRCA1 باستخدام محررات قاعدة CRISPR-بوساطة

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

العزل والتقييم الوظيفي للخلايا الجذعية لسرطان الثدي البشري من عينات الخلايا والأنسجة

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

التنميط من MicroRNAs الاستروجين التنظيم في خلايا سرطان الثدي

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Medicine

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same pathway, are likely to fail. Emphasis must be placed upon the inhibition of pathways that are responsible for intrinsic and/or adaptive resistance to therapy. An active field of investigation is the development and testing of DNA repair inhibitors that promote the action of, and prevent resistance to, commonly used chemotherapy and radiotherapy. We used a novel protocol to evaluate the effectiveness of BRCA2 inhibition as a means to sensitize tumor cells to the DNA damaging drug cisplatin. Tumor cell metabolism (acidification and respiration) was monitored in real-time for a period of 72 hr to delineate treatment effectiveness on a minute by minute basis. In combination, we performed an assessment of metastatic frequency using a chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM) model of extravasation and invasion. This protocol addresses some of the weaknesses of commonly used in vitro and in vivo methods to evaluate novel cancer therapy regimens. It can be used in addition to common methods such as cell proliferation assays, cell death assays, and in vivo murine xenograft studies, to more closely discriminate amongst candidate targets and agents, and select only the most promising candidates for further development.

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.

تقييم فعالية سرطان المخدرات توعية<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the BRCA1 have been complicated by the lack of a robust assay for the full length BRCA1 protein and the difficulties inherent in working with cell lines that express hypomorphic BRCA1 protein1,2,3,4,5. We developed a system whereby the endogenous BRCA1 protein in a cell was acutely depleted by RNAi targeting the 3'-UTR of the BRCA1 mRNA and replaced by co-transfecting a plasmid expressing a BRCA1 variant. One advantage of this procedure is that the acute silencing of BRCA1 and simultaneous replacement allow the cells to grow without secondary mutations or adaptations that might arise over time to compensate for the loss of BRCA1 function. This depletion and add-back procedure was done in a HeLa-derived cell line that was readily assayed for homologous recombination activity. The homologous recombination assay is based on a previously published method whereby a recombination substrate is integrated into the genome (Figure 1)6,7,8,9. This recombination substrate has the rare-cutting I-SceI restriction enzyme site inside an inactive GFP allele, and downstream is a second inactive GFP allele. Transfection of the plasmid that expresses I-SceI results in a double-stranded break, which may be repaired by homologous recombination, and if homologous recombination does repair the break it creates an active GFP allele that is readily scored by flow cytometry for GFP protein expression. Depletion of endogenous BRCA1 resulted in an 8-10-fold reduction in homologous recombination activity, and add-back of wild-type plasmid fully restored homologous recombination function. When specific point mutants of full length BRCA1 were expressed from co-transfected plasmids, the effect of the specific missense mutant could be scored. As an example, the expression of the BRCA1(M18T) protein, a variant of unknown clinical significance10, was expressed in these cells, it failed to restore BRCA1-dependent homologous recombination. By contrast, expression of another variant, also of unknown significance, BRCA1(I21V) fully restored BRCA1-dependent homologous recombination function. This strategy of testing the function of BRCA1 missense mutations has been applied to another biological system assaying for centrosome function (Kais et al, unpublished observations). Overall, this approach is suitable for the analysis of missense mutants in any gene that must be analyzed recessively.

We provide a method for testing BRCA1 variants in a tissue culture based assay for homologous recombination repair of DNA damage by depleting endogenous BRCA1 protein from a cell using RNAi and replacing it with a BRCA1 point mutant that contains a coding change.

تحديد آثار الطفرات BRCA1 على التوحد باستخدام خلايا متماثلة التي تعبر عن الذاتية وحشية من نوع BRCA1

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the ...

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among traditional technologies, RNA interference suffers from partial target abrogation and the requirement for life-long treatments. In contrast, artificial nucleases can impose stable gene inactivation through induction of a DNA double strand break (DSB), but recent studies are questioning the safety of this approach. Targeted epigenetic editing via engineered transcriptional repressors (ETRs) may represent a solution, as a single administration of specific ETR combinations can lead to durable silencing without inducing DNA breaks.
ETRs are proteins containing a programmable DNA-binding domain (DBD) and effectors from naturally occurring transcriptional repressors. Specifically, a combination of three ETRs equipped with the KRAB domain of human ZNF10, the catalytic domain of human DNMT3A and human DNMT3L, was shown to induce heritable repressive epigenetic states on the ETR-target gene. The hit-and-run nature of this platform, the lack of impact on the DNA sequence of the target, and the possibility to revert to the repressive state by DNA demethylation on demand, make epigenetic silencing a game-changing tool. A critical step is the identification of the proper ETRs&#39; position on the target gene to maximize on-target and minimize off-target silencing. Performing this step in the final ex vivo or in vivo preclinical setting can be cumbersome.
Taking the CRISPR/catalytically dead Cas9 system as a paradigmatic DBD for ETRs, this paper describes a protocol consisting of the in vitro screen of guide RNAs (gRNAs) coupled to the triple-ETR combination for efficient on-target silencing, followed by evaluation of the genome-wide specificity profile of top hits. This allows for reduction of the initial repertoire of candidate gRNAs to a short list of promising ones, whose complexity is suitable for their final&#160;evaluation in the therapeutically relevant setting of interest.

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Here, we present a protocol for the in vitro selection of engineered transcriptional repressors (ETRs) with high, long-term, stable, on-target silencing efficiency and low genome-wide, off-target activity. This workflow allows for reducing an initial, complex repertoire of candidate ETRs to a short list, suitable for further evaluation in therapeutically relevant settings.

في المختبر اختيار مثبطات النسخ المهندسة لإسكات الجينات اللاجينية المستهدفة

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among ...

Bioengineering

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

سيرنا فحص لتحديد اليوبيكويتين واليوبيكويتين مثل المنظمين نظام مقررات تمهيدية البيولوجية في خلايا الثدييات مثقف

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on cancer, and especially cancer genetics. Current knowledge and future discoveries will make it necessary to study a huge number of genes that could be involved in a genetic predisposition to cancer. In this regard, we developed a Nextera design to study 11 complete genes involved in DNA damage repair. This protocol was developed to safely study 11 genes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, and TP53) from promoter to 3&#39;-UTR in 24 patients simultaneously. This protocol, based on transposase technology and gDNA enrichment, gives a great advantage in terms of time for the genetic diagnosis thanks to sample multiplexing. This protocol can be safely used with blood gDNA.

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.

gDNA التخصيب من قبل القائم على تقنية Transposase لتحليل NGS من تسلسل كامل ل<em&gt; BRCA1</em&gt;،<em&gt; BRCA2</em&gt;، و 9 الجينات المسؤولة عن إصلاح الحمض النووي الأضرار

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.

إسكات

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video