Name: functional characterization of na+/h+ exchangers of intracellular compartments using proton-killing selection to express them at the plasma membrane
Uploaded: 2015-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane at JoVE.c

The authors are deeply indebted to all the members of the scientific community working on pH and ion transport, who have originated and improved the measurements described here. They particularly thank Dr. Jacques Pouyss&#233;gur who originated the H+-killing selection technique used here. They acknowledge the University of Nice-Sophia Antipolis, the CNRS, the ANR (JCJC SVSE1 NHEint) and the ICST Labex for support.

1. H + قتل اختيار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خطوط الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثابت بالنقل خلايا NHE التي تعاني من نقص (على سبيل المثال، PS120 خط الخلية المستمدة CCL39 16) باستخدام أي مزيج من متجه التعبير الثدييات وطريقة ترنسفكأيشن من شأنها أن تنتج عائدات ترنسفكأيشن كفاءة والتحديد في خط الخلية الليفية. ملاحظة: لسنوات عديدة كانت تستخدم فوسفات الكالسيوم هطول الأمطار 19 مع عائدات ترنسفكأيشن جيدة. تم استبدال هذا أكثر مؤخرا من قبل الكواشف التجارية مثل Lipofectamine2000، وtransfections الذي يقوم باتباع تعليمات الشركة المصنعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ثلاثة حلول عقيمة وصفها على النحو التالي. تعقيم هذه الحلول عن طريق الترشيح (0.22 ميكرون). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد NH 4 + الحل تحميل (7.4 درجة الحموضة) تتألف من 50 ملي NH 4 CL، 70 ملي كلوريد الكولين، 5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 5 ملي GLucose و 15 ملي اجتماعات الأطراف في درجة الحموضة 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل شطف (درجة الحموضة 7.0) تتألف من 120 ملي كلوريد الكولين، 5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، الجلوكوز 5 ملي و 15 ملي HEPES في درجة الحموضة 7.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل الاسترداد (7.4 درجة الحموضة) تتألف من 120 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 5 ملي الجلوكوز و 15 ملي HEPES في درجة الحموضة 7.4. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البدء في الاختيار، والحصول على حاضنة الثقافة الخلية التي يمكن استخدامها عند 37 درجة مئوية مع عدم وجود CO إضافي 2 من خزان الوقود الخارجي (وهو ما يسمى CO 2 - حاضنة &quot;الحرة&quot;)، و5٪ CO 2 سيؤدي إلى التخزين المؤقت التي قد تنال من التحميض. تضخيم خط الخلية تعبر عن NHE من الفائدة تصل إلى حوالي 2 × 10 8 خلايا (عادة حوالي 20 متكدسة 100 لوحات ملم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> H + قتل الإجراء: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا معربا عن NHE داخل الخلايا من الفائدة لمدة 1 ساعة في الحل تحميل، في 37 ° C في الحاضنة خالية من CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الحل التحميل وثم شطف لهم مرتين في الحل وصفها-شطف أعلاه. تنفيذ هذه الخطوة بشكل فعال للقضاء على المتبقي خارج الخلية NH 4 الكلورين التي من شأنها أن تنال من إنشاء حاد NH 4 + التدرج من شأنها أن تولد والتحميض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القضاء على المديين المتوسط ​​شطف بواسطة الطموح واحتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة في حل الانتعاش مرة أخرى عند 37 درجة مئوية في حاضنة المجانية CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال المتوسطة الانتعاش مع مستنبت منتظمة (عادة DMEM مع 7.5٪ FCS) وتنمو الخلايا في ظروف الثقافة القياسية (37 درجة مئوية في جو مرطب من CO 2 و 95٪ الجوية 5٪). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر هذه الدورة من اختيار مرتين في الأسبوع حتى تظهر الحيوانات المستنسخة مستقرة. ملاحظة: خذ رعاية خاصة فيما يتعلق زراعة الخلايا وشروط الاختيار. أشهر من العمل يمكن أن تكون مدمرة من قبل أي تلوث التي هي أكثر عرضة للسccur بعد فترة طويلة من الثقافة والتلاعب خلية المتكررة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هنا، اختر ما إذا لتضخيم الحيوانات المستنسخة وتميز منهم على حدة كما هو موضح في أقسام 2-3، أو تجمع لهم معا لتوليد سكان الخلوي قبل التوصيف. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق الاختيار بين الحين والآخر (حوالي مرة كل أسبوعين) للاحتفاظ خلايا مقاومة للحموضة من قبل تلك التي ربما تكون قد عادت إلى حساسة للحمض النمط الظاهري الوالدين (الشكل 1B)، اختيار المضاد. </li></ol> 2. بين الخلايا درجة الحموضة القياسات 2.1) التصوير الإسفار درجة الحموضة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ratiometric الحساسة درجة الحموضة الفلورسنت صبغ BCECF / AM، وهو الرقم الهيدروجيني الحساسة عندما متحمس في 490 نانومتر، وتمتلك 445 نقطة isosbestic نانومتر، بعد بروتوكولات المصنعة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك، استخدام غيرها من تحقيقات حساسة للدرجة الحموضة، وبعد بروتوكولات الشركة المصنعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام التصوير المنصوص يخدعsisting من مجهر مقلوب بالإضافة إلى كاميرا فيديو عالية الحساسية. تجهيز هذه المجموعة مع 450 نانومتر و 490 نانومتر الضيقة المرشحات تدخل الفرقة يقترن الكوارتز المناسبة مرشحات الكثافة محايدة لالإثارة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان ذلك ممكنا، استخدم مجموعة مناسبة من المرشحات وشروط الإضاءة لإعداد قيم مضان مماثلة لλ1 وλ2 بحيث تقترب نسبة 1. أيضا تجنب القيم مضان القاعدية التي تم تعيينها إما تشبع أو منخفضة جدا، سواء بالنسبة للλ1 و / أو λ2. وهذا قد تسفر عن القطع الأثرية الهامة كما ثم نسبة قد يكن كشفها على الرغم من أن درجة الحموضة داخل الخلايا يتغير. ملاحظة: هذا النظام يجب تمكين نضح السريع، والإثارة في الوقت الفاصل بين اثنين من موجات المذكورة أعلاه والاستحواذ في الطول الموجي الانبعاثات السليم (535 نانومتر لBCECF). تجهيز نظام مع برنامج تمكين الحصول على البيانات التلقائي والتخزين. </li></ol></li></ol> 2.2) قياس NHE إلى الأمام آخر (بثقالبروتونات من العصارة الخلوية) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحمض الخلايا عن طريق حضانة 1 ساعة في حل NH 4 + التحميل (راجع الخطوة 1.4) في غياب CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة BCECF-AM (5 ميكرومتر تركيز النهائي) إلى حل لآخر خمس دقائق ومن ثم شطفه مع NH 4 + الحل تحميل للقضاء على التحقيق خارج الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيب الخلايا على المجهر وأخذ عدة صور لتسجيل خط الأساس مستقرة. يروي الحل شطف (انظر أعلاه). وهذا يؤدي إلى انخفاض في مضان المقابلة لالتحميض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد استقرار درجة الحموضة، ويروي أي من الحلول الواردة أدناه لقياس معدلات الاسترداد درجة الحموضة بوساطة لي + / H +، نا + / H + K + أو / H + الصرف. يحتوي كل حل كاتيون اقتران المحتملين لفحصها لH + الصرف. إذا تم نقل واحد من هؤلاء، وهذا سوف يؤدي إلى زيادة مضان في 495 نانومتر التي سوف الموافقأندو إلى زيادة في درجة الحموضة داخل الخلايا: 120 ملي LiCl، 5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 5 ملي الجلوكوز و 15 ملي HEPES في درجة الحموضة 7.4 120 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 5 ملي الجلوكوز و 15 ملي HEPES في درجة الحموضة 7.4 125 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 5 ملي الجلوكوز و 15 ملي HEPES في درجة الحموضة 7.4 </li></ol> 2.3) قياس NHE آخر عكسي ملاحظة: إن المبدأ هنا هو عكس الغشاء التدرجات الأيونية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل القياس، تحميل الخلايا مع الموجبة داخل الخلايا من الفائدة (انظر أدناه). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لهم لمدة 5 دقائق مع BCECF / AM (راجع الخطوة 2.2.2)؛ شطف لهم، جبل لهم على المجهر الفيديو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يروي الحل التحميل وتأخذ عدة صور لتسجيل خط الأساس مستقرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد استقرار خط الأساس، صورة الاختلافات درجة الحموضة عند و perfused الخلايا مع وسيلة الحمضية خارج الخلية التي تحتوي على 120 مM كلوريد الكولين، 5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 5 الجلوكوز ملي و 15 ملي زارة التربية والعلم في درجة الحموضة 6.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لLiCl التحميل واحتضان خلايا لمدة 2 ساعة في محلول مكون من 120 ملي LiCl، 5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 5 ملي الجلوكوز و 15 ملي HEPES في درجة الحموضة 7.4. الليثيوم داخل الخلايا يقاس الامتصاص الذري الطيفي غلة قيمتها نحو 60 ملي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لنا + التحميل واحتضان خلايا لمدة ساعتين في محلول مكون من 120 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 5 ملي الجلوكوز و 15 ملي HEPES في درجة الحموضة 7.4 بحضور 1 ملم ابائين لمنع نا / K أتباز. في هذه الظروف، بين الخلايا تركيز نا + هو في حدود 40 مم. ملاحظة: K + تحميل ليس من الضروري كما K + عصاري خلوي التركيز هو في حدود 140 مم وموجهة ظاهريا-K + التدرج هو بالتالي من السهل تحقيق. </li></ol> 2.4) العلاج ومعايرة البيانات: ملاحظة: هذه الخطوة ينطبق على كل من القياسات إلى الأمام وعكس. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نهاية كل تجربة، يروي خلايا بمحلول مكون من 140 ملي بوكل، 20 ملي HEPES و 5 ميكرومتر nigericin تعديلها لقيم درجة الحموضة ما بين 6.5 و 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع البيانات والقياسات مضان من الصور (مستويات الرمادي تمثل مستويات كثافة) والتصدير تحت تنسيق النص وعلاج كما هو موضح أدناه باستخدام برنامج جدول بيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب القيم الرقم الهيدروجيني بين الخلايا لكل خلية فردية أو المنطقة ذات الاهتمام باستخدام المعادلة التالية: الرقم الهيدروجيني = + الباكاف الحمضية (سجل (R-RMIN) / (ماكس R -R)) × F دقيقة (λ2) / F ماكس (λ2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام دقيقة F (λ2) / F أماه العاشر (λ2) نسبة إذا كان هناك تحقيق تبييض أو تسرب، مما أدى إلى انخفاض في مضان 450 نانومتر في جميع أنحاء التجارب. هذا هو ولكن نادرا جدا ما لوحظ في الظروف المستخدمة في ديستجارب cribed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما موجودة في نهاية كل قياس درجة الحموضة بيانات المعايرة، والتحقق ما إذا كانت القيم المحسوبة المناظرة تختلف عن قيم الرقم الهيدروجيني المستخدمة في المعايرة. إذا كان هذا هو الحال، ثم ضبط جميع القيم الرقم الهيدروجيني تجريبيا لمعايرة باستخدام الإجراء التالي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب حاصل التالية (Q، والفرق بين القيم المقاسة / الفرق بين القيم المعايرة). مضاعفة بيانات كله Q. جعل التعديل النهائي من قبل الجمع أو الطرح بحيث القيم المحسوبة سوف تساوي القيم المعايرة المقابلة. </li></ol></li></ol> 3. قياسات معدلات الأولية للNHE7 التي كتبها سريع لي + امتصاص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا البذور على لوحات متعددة جيدا (6 إلى 24 عاما أيضا) وتحمض لهم باستخدام إما NH 4 تقنية + تحميل المذكورة أعلاه أو بالتناوب nigericin / البقري ألبومين المصل (BSA) تحمض وصفها في 20. </li><lI&gt; لوحات شطف مرتين بسرعة باستخدام محلول شطف المبين أعلاه ثم احتضان الخلايا في امتصاص الحلول التي تحتوي على 1-10 ملم الليثيوم (أقل قليلا من القيم كم) وتركيزات المطلوب من الكاتيونات و / أو مثبطات التي تهم المبلغ المطلوب من الزمن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على فترات امتصاص قصيرة ومتسقة (عادة دقيقة واحدة أو أقل) لضمان حسن سير هذا النقل في ظروف معدلات الأولية. وتأكد أيضا من أن جميع الحلول المستخدمة لامتصاص هي متساوي التوتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نهاية الوقت امتصاص، والقضاء على بعناية المتوسطة امتصاص وغسل الخلايا أربع مرات مع المالحة الفوسفات الجليد الباردة مخزنة (PBS). تنفيذ هذه يغسل بأسرع وقت ممكن (أقل من 10 ثانية لأربعة منهم هو المثالي) لمنع هروب رأس المال الليثيوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليز الخلايا في 25٪ حمض النيتريك. تطبيق 250 ميكرولتر لكل بئر من 25٪ حمض النيتريك والسماح لها الجلوس لمدة 1 ساعة على الأقل، ثم إلغاء كل بئر مع نهاية غيض ماصة ونقل تعليق جيدا كله في ميل جديدأنبوب crocentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المحللة في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge، الطرد المركزي لهم لمدة 5 دقائق على 15،000 x ج (درجة حرارة الغرفة) لإزالة الحطام الخلوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس محتوى الليثيوم من supernatants بواسطة الامتصاص الذري الطيفي 21. ملاحظة: توفر شركات مختلفة الطيف الامتصاص الذري، والتي يجب أن تكون مجهزة ليثيوم مصباح الكاثود جوفاء. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لأن هذه الآلات هي دقيقة جدا ولكن أيضا حساسة جدا. </li></ol>

<ol>
	<li>Marshansky, V., Futai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+V-type+H+-ATPase+in+vesicular+trafficking:+targeting,+regulation+and+function.">The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).</li><li>Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloride+and+the+endosomal-lysosomal+pathway:+emerging+roles+of+CLC+chloride+transporters.">Chloride and the endosomal-lysosomal pathway: emerging roles of CLC chloride transporters.</a> J Physiol. 578 (3), 633-640 (2007).</li><li>Kornak, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+a3+subunit+of+the+vacuolar+H(+)-ATPase+cause+infantile+malignant+osteopetrosis.">Mutations in the a3 subunit of the vacuolar H(+)-ATPase cause infantile malignant osteopetrosis.</a> Hum Mol Genet. 9 (13), 2059-2063 (2000).</li><li>Gunther, W., Piwon, N., Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ClC-5+chloride+channel+knock-out+mouse+-+an+animal+model+for+Dent's+disease.">The ClC-5 chloride channel knock-out mouse - an animal model for Dent's disease.</a> Pflugers Arch. 445 (4), 456-462 (2003).</li><li>Kasper, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+chloride+channel+ClC-7+leads+to+lysosomal+storage+disease+and+neurodegeneration.">Loss of the chloride channel ClC-7 leads to lysosomal storage disease and neurodegeneration.</a> Embo J. 24 (5), 1079-1091 (2005).</li><li>Poet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+storage+disease+upon+disruption+of+the+neuronal+chloride+transport+protein+ClC-6.">Lysosomal storage disease upon disruption of the neuronal chloride transport protein ClC-6.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13854-13859 (2006).</li><li>Nakamura, N., Tanaka, S., Teko, Y., Mitsui, K., Kanazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+Na+/H++exchanger+isoforms+are+distributed+to+Golgi+and+post-Golgi+compartments+and+are+involved+in+organelle+pH+regulation.">Four Na+/H+ exchanger isoforms are distributed to Golgi and post-Golgi compartments and are involved in organelle pH regulation.</a> J Biol Chem. 280 (2), 1561-1572 (2005).</li><li>Gilfillan, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLC9A6+mutations+cause+X-linked+mental+retardation,+microcephaly,+epilepsy,+and+ataxia,+a+phenotype+mimicking+Angelman+syndrome.">SLC9A6 mutations cause X-linked mental retardation, microcephaly, epilepsy, and ataxia, a phenotype mimicking Angelman syndrome.</a> Am J Hum Genet. 82 (4), 1003-1010 (2008).</li><li>Mignot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+mutation+in+SLC9A6+gene+in+a+patient+with+Christianson+syndrome+and+retinitis+pigmentosum.">Novel mutation in SLC9A6 gene in a patient with Christianson syndrome and retinitis pigmentosum.</a> Brain &amp; Development. 35 (2), 172-176 (2013).</li><li>Morrow, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+autism+loci+and+genes+by+tracing+recent+shared+ancestry.">Identifying autism loci and genes by tracing recent shared ancestry.</a> Science. 321 (5886), 218-223 (2008).</li><li>Lasky-Su, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+scan+of+the+time+to+onset+of+attention+deficit+hyperactivity+disorder.">Genome-wide association scan of the time to onset of attention deficit hyperactivity disorder.</a> Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 147B (8), 1355-1358 (2008).</li><li>Franke, B., Neale, B. M., Faraone, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+studies+in+ADHD.">Genome-wide association studies in ADHD.</a> Hum Genet. 126 (1), 13-50 (2009).</li><li>Meda, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+scale+multivariate+parallel+ICA+method+reveals+novel+imaging-genetic+relationships+for+Alzheimer's+disease+in+the+ADNI+cohort.">A large scale multivariate parallel ICA method reveals novel imaging-genetic relationships for Alzheimer's disease in the ADNI cohort.</a> Neuroimage. 60 (3), 1608-1621 (2012).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microdeletion+in+Xp11.3+accounts+for+co-segregation+of+retinitis+pigmentosa+and+mental+retardation+in+a+large+kindred.">A microdeletion in Xp11.3 accounts for co-segregation of retinitis pigmentosa and mental retardation in a large kindred.</a> Am J Med Genet A. 140 (4), 349-357 (2006).</li><li>Sardet, C., Franchi, A., Pouyss&#233;gur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning,+primary+structure,+and+expression+of+the+human+growth+factor-activatable+Na+/H++antiporter.">Molecular cloning, primary structure, and expression of the human growth factor-activatable Na+/H+ antiporter.</a> Cell. 56 (2), 271-280 (1989).</li><li>Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+mutation+abolishing+Na+/H++antiport+activity+in+hamster+fibroblasts+precludes+growth+at+neutral+and+acidic+pH.">A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).</li><li>Franchi, A., Cragoe, E., Pouyss&#233;gur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+properties+of+fibroblast+mutants+overexpressing+an+altered+Na+/H++antiporter.">Isolation and properties of fibroblast mutants overexpressing an altered Na+/H+ antiporter.</a> J Biol Chem. 261 (31), 14614-14620 (1986).</li><li>Milosavljevic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Intracellular+Na+/H++Exchanger+NHE7+effects+a+Na++coupled,+but+not+K++coupled+proton-loading+mechanism+in+endocytosis.">The Intracellular Na+/H+ Exchanger NHE7 effects a Na+ coupled, but not K+ coupled proton-loading mechanism in endocytosis.</a> Cell Reports. 7 (3), 1-8 (2014).</li><li>Wigler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+mammalian+cells+with+genes+from+procaryotes+and+eucaryotes.">Transformation of mammalian cells with genes from procaryotes and eucaryotes.</a> Cell. 16 (4), 777-785 (1979).</li><li>Lacroix, J., Po&#235;t, M., Maherel, C., Counillon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+the+activation+of+the+Na/H+exchanger+NHE-1+by+cytoplasmic+acidification+and+mitogens.">A mechanism for the activation of the Na/H exchanger NHE-1 by cytoplasmic acidification and mitogens.</a> EMBO Reports. 5 (1), 91-96 (2004).</li><li>Milosavljevic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nongenomic+Effects+of+Cisplatin:+Acute+Inhibition+of+Mechanosensitive+Transporters+and+Channels+without+Actin+Remodeling.">Nongenomic Effects of Cisplatin: Acute Inhibition of Mechanosensitive Transporters and Channels without Actin Remodeling.</a> Cancer Res. 70 (19), 7514-7522 (2010).</li><li>Boron, W. F., De Weer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+transients+in+squid+giant+axons+caused+by+CO2,+NH3,+and+metabolic+inhibitors.">Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors.</a> J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).</li><li>Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+-H++exchange+in+gastric+glands+as+measured+with+a+cytoplasmic-trapped,+fluorescent+pH+indicator.">Na+-H+ exchange in gastric glands as measured with a cytoplasmic-trapped, fluorescent pH indicator.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (23), 7436-7440 (1984).</li><li>Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+image+processing+of+intracellular+pH+in+gastric+oxyntic+and+chief+cells.">Digital image processing of intracellular pH in gastric oxyntic and chief cells.</a> Nature. 325, 447-450 (1987).</li><li>Quentin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhBG+and+RhCG,+the+putative+ammonia+transporters,+are+expressed+in+the+same+cells+in+the+distal+nephron.">RhBG and RhCG, the putative ammonia transporters, are expressed in the same cells in the distal nephron.</a> J Am Soc Nephrol. 14 (3), 545-554 (2003).</li><li>Geyer, R. R., Musa-Aziz, R., Enkavi, G., Mahinthichaichan, P., Tajkhorshid, E., Boron, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+of+NH3+through+the+human+urea+transporter+B:+a+new+gas+channel.">Movement of NH3 through the human urea transporter B: a new gas channel.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 304 (12), F1447-F1457 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

يصف هذا البروتوكول وكيفية اختيار الخلايا معربا داخل الخلايا نا + / H + المبادلات في غشاء البلازما دون تغيير تسلسل الأساسي من خلال الطفرات موقع الموجه. ويمكن الآن أن تتسم هذه المبادلات. ويستند هذا الأسلوب على سمية الخلوية من البروتونات داخل الخلايا لتحديد خطوط الخلايا التي من شأنها التعبير عن حويصلي نا + / H + المبادلات في غشاء البلازما. قد يكون من الممكن، من حيث المبدأ، لاستخدام الكاتيونات الأخرى التي قد يشتبه في نقلها، مثل لي +، K +، أو جيم +. ومع ذلك، وهذا يضيف مستوى إضافي من عدم اليقين. إذا لا اختيار تسفر عن أي استنساخ إيجابي، وسوف يكون من الصعب بعد ذلك لتقييم ما إذا كانت الموجبة اختبار لا تنقل أو مبادل ليس في الغشاء البلازمي. لهذه الأسباب، فقد تم إجراء التحديدات باستخدام نا + باعتباره الموجبة اقتران لأن هذا هو SUBSTR خارج الخليةيأكلون وجدت في أعلى وفرة في الظروف الفسيولوجية. وأدى ذلك إلى اختيار المتغيرات معربا عن NHE7 18، وكذلك NHE6 وNHE9 في غشاء البلازما (شاعر وCounillon، ونتائج غير منشورة). هذا التعبير غشاء البلازما يمكن قياس النقل المعلمات الوظيفية التي كتبها الأساليب التي يمكن حتى الآن أن تستخدم فقط لنقل غشاء البلازما. بالطبع ليس من الممكن استبعاد أن مثل هذا التغيير في البيئة الغشاء قد تؤثر على ميزات وظيفية NHEs حويصلي. ومع ذلك، فإن هذه الاستراتيجية قد يكون من المفيد استخدام لمدة ثلاثة أسباب على الأقل: (ط) التعبير داخل الخلايا NHE6 و 7 و 9 يحول دون أي قياس وظيفي مفصل، (ب) ومعظمها ثبت بيئات الغشاء والبروتين أو الدهون الشركاء لتؤثر خفية التنظيمية آليات NHEs البعض وليس على ميزات أساسية جدا من هذه الناقلين (الانتماءات لالكاتيونات اقتران والانتقائية، اتجاهها، ودرجة الحموضةميزات armacological). ولذلك فمن المحتمل جدا أن تلك ستبقى دون تغيير عن طريق التعبير غشاء من NHEs حويصلي. (ج) معرفة آليات الوظيفية وملامح الدوائية آلية حويصلي أعرب غشاء البلازما، فمن الممكن بعد ذلك لإجراء قياسات حويصلي الرقم الهيدروجيني للتصدي لتلك التناقضات المحتملة بين غشاء البلازما والتعبير الحويصلي. آخر القيد المحتمل لهذه التقنية هو أن استراتيجية الموصوفة هنا قد يؤدي إلى اختيار الخلايا معربا عن الآخرين H + البثق آلية من حويصلي transfected نا + / H + مبادل (مثل NHE غشاء البلازما، أو H + أتباز على سبيل المثال ). على الرغم من أنه لوحظ أبدا في المختبر، ولذلك فمن الأهمية بمكان استخدام الكلاسيكية وضع العلامات سطح الخلية بالإضافة إلى إسكات للتحقق في الواقع أن NHE من الفائدة يتم التعبير عن الواقع في غشاء البلازما وتتوسط نا + أو لي + </sتصل&gt; معتمد على بروتون هروب رأس المال (انظر على سبيل المثال ميلوسافليفيتش وآخرون 18). لوصف نشاط هذه الناقلين، بروتوكولين، استنادا على التوالي على الاختلافات درجة الحموضة داخل الخلايا وتدفقات ايون وصفها. يتطلب الأسلوب الأول استخدام تحقيقات الفلورسنت الحساسة درجة الحموضة ونظام ملائم المجهري مضان الفيديو. هذا الأسلوب، الذي يستخدم من قبل العديد من الجماعات في هذا المجال، وقد وضعت في 1980s، أولا باستخدام fluorimeters لقياس خلايا شكل إشارات في تعليق 23، ثم استخدام اقتناء التكنولوجيا الرقمية لقياس الخلايا الفردية من قبل اقتران الإثارة مضان والاستحواذ على videomicroscopy 24. أصبحت هذه التقنية الأخيرة الآن سريع جدا وسهلة، وذلك بسبب الأداء العالي من الكاميرات، والإضاءة وأنظمة الكمبيوتر. ومن المثير للاهتمام، وشركات ما تقدم ورقة تقنية مفيدة للغاية جنبا إلى جنب مع تحقيقات الفلورسنت الخاصة بهم. وتوفر هذه الاختلافات درجة الحموضة معلومات هامةلتحديد طبيعة الكاتيونات خارج الخلية إلى جانب بروتون هروب رأس المال. وفي هذا الصدد، من المهم أن نلاحظ أن مدة حضن مسبق الأمونيوم لابد من تعديلها بعناية تبعا للخلايا المستخدمة في القياسات. الليفية المشتقة من CCL39، ودعم بشكل جيد جدا على تحميل ساعة واحدة مع 50 ملي NH 4 الكلورين. وهذا يؤدي إلى تحمض قوية جدا تمكن NHE تفعيل كامل وتنتج إشارة قوية للمقاييس (شروط VMAX). ومع ذلك، فإن الخلايا الأخرى مثل العضلية أو خلايا الكلى الأولية لا تدعم مثل هذا تحميل الأمونيوم المهم. ومن الجدير أداء العديد من التجارب الأولية مع أوقات حضانة مختلفة أو NH 4 تركيزات الكلور. سبب هذه الاختلافات في الحساسية للNH 4 الكلورين ليست واضحة. أنها قد تكون ذات صلة إلى التعبير الممكن نظم النقل الأمونيوم 25،26. وبالمثل، فإن الحل خالية من الصوديوم الذي يستخدم لالشطف الحل تحميل قد لا يتم التسامحمن الخلايا، مثل العضلية على سبيل المثال. على الرغم من أن السرعات الأولية وسيتم تحديد أقل دقة، فمن الضروري أن يروي مباشرة مع الحل الانتعاش بعد تحميل الأمونيوم. وبالإضافة إلى ذلك، وقياسات درجة الحموضة داخل الخلايا أيضا توفير وسيلة مباشرة للتحقيق في خصائص عكسها من هذه المبادلات كوضع العكسي سوف ينتج تحمض التي سيتم الكشف بسهولة عن طريق انخفاض في مستوى مضان BCECF التي يمكن التعبير عنها قيم درجة الحموضة المعايرة التالية . القيود المفروضة على هذه التجارب هي عدم وجود تقدير دقيق لأنشطة النقل، حيث أن الاختلافات درجة الحموضة التجارب التدبير، التي تعمل على مقياس لوغاريتمي ومحدودة بسبب قدرة التخزين المؤقت داخل الخلايا. هذا الأخير يمكن قياس درجة الحموضة والاختلافات مضروبا قدرة التخزين المؤقت تدفقات العائد أيون. ومع ذلك، فإن هذه العملية يجمع بين العديد من الأخطاء التجريبية (على قياسات درجة الحموضة، والقياسات قدرة التخزين المؤقت، وcalibraلذا نشوئها) وليس الكمي للغاية. وبالتالي الوصول إلى الثوابت الأنزيمية للغشاء البلازما أعرب نقل، وتقنيات تدفق أيون السريع هي أكثر وضوحا ودقة. لأن محتويات الخلايا هي في حدود millimolar، والكشف عن التغيرات NHE بوساطة من الصوديوم عصاري خلوي غير ممكن. من الآن فصاعدا، لسنوات استندت هذه التقنيات امتصاص حول استخدام النظائر المشعة مثل 22 + نا. توضح هذه المخطوطة طريقة غير المشعة التي يتم استبدال 22 + نا من قبل الليثيوم، واستنادا إلى المنطق أن هذا الموجبة والذي يستخدم أيضا من قبل NHEs، غائب من العصارة الخلوية الخلية ويمكن قياسها بدقة كبيرة باستخدام مطياف الامتصاص الذري 21. مرة واحدة في ظروف مناسبة (الوقت وتركيز الليثيوم) لقياس جرعات الخطية (أي.، ويجري في ظروف معدلات الأولية) يتم تحديدها، لالانتماءات الأخرى الكاتيونات اقتران المحتملة و / أومثبطات يمكن قياسها بدقة كما هو موضح في أرقام 3 و 4. وجود قيود محتملة الأخير هو أن طريقة امتصاص الليثيوم يمكن بالطبع تعمل إلا إذا كان مبادل من الفائدة وسائل النقل بشكل كبير هذا الموجبة. إذا لم يكن كذلك، سوف المجرب أن تعتمد إما على قياسات درجة الحموضة داخل الخلايا المذكورة أعلاه أو سوف تضطر إلى استخدام امتصاص الصوديوم المشع. مثل مجموعة من التجارب أدت أدى مؤخرا إلى ملاحظة أن NHE7 داخل الخلايا نا + / H + المبادلات، الذي كان يعتقد في البداية أن يكون H + / K + نقل التي من شأنها أن قلونة الحويصلات كان في الواقع آلية endosomal تحمض مقترنة إلى الصوديوم 18. وهذا له آثار عميقة للسيارة داخل الخلايا كما كان يعتقد حتى الآن هذا الدور من أجل تكريسها لVH + ATPases. كما يظهر كل فرد من أفراد الأسرة NHE لعرض التوقيع الحركي محددة جدا سالجناح لدورها الفسيولوجي، ومن المغري لنفترض أن توصيف NHE6 وNHE9 باستخدام الطرق الموضحة في هذه المقالة سوف تكشف الرواية وميزات غير متوقعة من شأنها أن تسليط الضوء على وظائفها الفيزيولوجية.

عرض معظم مقصورات درجة الحموضة داخل الخلايا اللمعية الحمضية، وهي معلمة رئيسية للنضوج، والاتجار، وإعادة التدوير من البروتينات أو الهرمونات والناقلات العصبية تحميل. وقد تبين أن يتم إنشاء التدرج درجة الحموضة بين العصارة الخلوية والحويصلي المحتوى من قبل فجوي H + ATPases 1، بالإضافة إلى حويصلي النقل كلوريد CLC 2. سواء في طرق المغادرة (KO) الفئران والمرضى من البشر، وقد تم تسليط الضوء على أهمية هذه الناقلين من الظواهر الثقيلة التي تسببها طفرات في جيناتها 3-6. ووصف أعضاء المبادلات الصوديوم والهيدروجين SLC9A الأسرة، وكذلك NHEs لنا + / H + المبادلات، وقد ثبت أن تكون المؤثرات الرئيسية في درجة الحموضة داخل الخلايا وتنظيم حجم الخلية، وكذلك في نقل اتجاهي من مكافئات الحمضي القاعدي عبر الظهارة . إلى جانب NHEs غشاء البلازما، وثلاثة حفظا للغاية نا + / H + المبادلات، NHE 6 و 7ويتم التعبير عن 9 في شبكة عابرة للجولجي والإندوسومات في وقت مبكر (7). وقد تم ربط الطفرات في الجينات مع Angelman تشبه أو كرستيانسون المتلازمات 8-9 والتوحد القائم على الأسرة 10 ونقص الانتباه فرط النشاط اضطراب 11-12. كما شاركت هذه المبادلات في المشاكل العصبية مثل مرض الزهايمر القابلية 13 و X-ربط التخلف العقلي الجينات متجاورة متلازمات 14. أخذت معا، وتبرز هذه الدراسات على أهمية هذه NHEs داخل الخلايا في نمو الدماغ و / أو وظيفة. توطين الخلايا من هذه المبادلات يمنع قياسات دقيقة من الانتقائية أيون، والاتجاه النقل والمعلمات الحركية، والتنظيم. كما هو الحال بالنسبة لجميع الناقلين أعرب في المقصورات داخل الخلايا، فإنه من الصعب للغاية لتقييم أنشطتها الحيوية، وبالتالي التوصل إلى فهم كامل أدوارهم الفسيولوجية وميكانالمذهبين الكامنة آثارها المرضية. وبناء على عصاري خلوي تركيز K + عالية، وكانت الفرضية الأكثر شيوعا قبلت أن كانوا يعملون كما K + جانب بروتون النقل هروب رأس المال. وكان وجود مثل تسرب بروتون تم الافتراض، لأنها قد موازنة بروتون ضخ من قبل V-ATPases من أجل الحفاظ على حالة الاستقرار حويصلي درجة الحموضة. والهدف من هذه المادة هو البصرية (ط) ليبرهن على وجود طريقة التي تسمح للاختيار الوراثية من خطوط الخلايا التي تعبر عن هذه الناقلين حويصلي في غشاء البلازما الخاصة بهم، و (ثانيا) لإظهار نهجين مستقلة لقياس وظائف هذه الناقلين. قبل ثلاثة عقود، Pouysségur وفرانكي كان لها السبق في نهج الجيني التي مكنت الاستنساخ الجزيئي وتوصيف أعضاء الأسرة NHE 15. وقد استند هذا على سمية البروتونات داخل الخلايا كوسيلة من وسائل الفحص. وكانت الخطوة الأولى للحصول على خطوط الخلايا ناقصةفي أي نا + / H + الصرف التي أعرب عنها في غشاء البلازما، وذلك باستخدام عكس هذا الناقل. تم مسبقة الخلايا الليفية (CCL39 خط خلية) مع نا + أو لي + ثم توضع في وسيلة خارج الخلية الحمضية (الرقم الهيدروجيني 6.5) لمدة 2 ساعة. وأدى ذلك إلى موت خلايا تعبر عن وظيفي نا + / H + الصرف واختيار خلايا antiporter ناقص (PS120 خط الخلية) 16. عندما يزرع في خالية من بيكربونات المتوسطة، وهذه الخلايا هي حساسة جدا لتحمض داخل الخلايا الحاد. ونتيجة لذلك، وسيتم اختيار التعبير عن أي آلية بروتون هروب رأس المال وظيفية في غشاء البلازما إيجابيا (انظر 17) إذا قدمت مثل هذه الخلايا إلى داخل الخلايا acidifications الحادة. تقنيات تحمض مثل هذه يمكن استخدامها لعزل خطوط الخلايا مع الاتجار العيوب تمكين التعبير القسري للNHEs داخل الخلايا WT على غشاء البلازما. كما حقيقية النواة نا + / H+ المبادلات هي electroneutral، فهي ليست قابلة للقياس من قبل النهج الكهربية التي استخدمت مع النجاح الكبير لقياس القنوات. لذا يوضح هذا المخطوط كيفية قياس نشاط هذا مبادل من قياسات درجة الحموضة داخل الخلايا وحركية السريع لامتصاص الليثيوم. كما المفاهيم الأساسية هي نفسها، ومن المثير للاهتمام أن نلاحظ أن العديد من العمليات التي وضعت لاختيار القسم تستخدم أيضا بشكل مباشر عن القياسات الوظيفية. ومن المثير للاهتمام، لاحظنا أن العيب الاتجار الحالي في خطوط الخلية المحددة باستخدام النهج الوارد وصفها في هذه المخطوطة يؤدي إلى التعبير أكبر من البروتينات حويصلي أخرى في غشاء البلازما مثل قناة البوتاسيوم حويصلي TWIK1 18. وهذا يشير إلى نحو اختيار آلية عيب الاحتفاظ العامة للبروتينات الغشاء حويصلي. وبالتالي هذا الإجراء الاختيار وخلايا أنه يولد مايوتشكل أداة واعدة بالنسبة للمجتمع العلمي تعمل على بروتينات الغشاء من المقصورات داخل الخلايا. وكذلك تقنيات قياس المقدمة هنا قد تكون قابلة للتطبيق لدراسة أخرى الناقلين غير كهربي.

<table><tbody><tr><td>Standard cell culture equipement</td><td></td><td></td><td>Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers</td></tr><tr><td>Incubator with CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sanyo</td><td>MCO15A</td><td></td></tr><tr><td>Incubator without CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Heraeus instrument</td><td>BB6220</td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow hood PSM1200NF</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>52010120</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>sigma</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>FBS gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/streptomycin</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 10x</td><td>PAA</td><td>L11-003</td><td></td></tr><tr><td>Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system</td><td>Thermo Scientific</td><td>ICE 3500 GFZ</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>sigma</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>Nitric Acid</td><td>sigma</td><td>438073</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence videomicroscopy set</td><td>Leica</td><td></td><td>Composed of many devices with different catalog numbers</td></tr><tr><td>Inverted automated microscope</td><td>Leica</td><td>DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td>microscope stand</td><td>leica</td><td>11888906</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888911</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11505180</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888377</td><td></td></tr><tr><td>incident fluorescence</td><td>leica</td><td>11888901</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11504166</td><td></td></tr><tr><td>motor bracket</td><td>leica</td><td>11888379</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11505234</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521505</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11522106</td><td></td></tr><tr><td>LED transmission light&amp;nbsp;</td><td>leica</td><td>8097321</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>8102034</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521580</td><td></td></tr><tr><td>motorized plate</td><td>leica</td><td>11522068</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11531172</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521734</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521719</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888423</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888424</td><td></td></tr><tr><td>camera output</td><td>leica</td><td>11888373</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11507807</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888393</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888259</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888258</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11541510</td><td></td></tr><tr><td>images acquisition/analysis software</td><td>leica</td><td>11888375</td><td></td></tr><tr><td>optics</td><td>leica</td><td>11506507</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11506243</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11506203</td><td></td></tr><tr><td>fluorescence Xenon lamp</td><td>leica</td><td>DMI6000</td><td></td></tr><tr><td>camera</td><td>hamamatsu</td><td>8100601</td><td></td></tr><tr><td>metafluor/Mmfluor software</td><td></td><td>11640905</td><td></td></tr><tr><td>pH sensitive probe, BCECF-AM</td><td>life technologies</td><td>B1170</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma</td><td>N7143</td><td></td></tr></tbody></table>

functional characterization of na+/h+ exchangers of intracellular compartments using proton-killing selection to express them at the plasma membrane

تحمض Endosomal أمر بالغ الأهمية لمجموعة واسعة من العمليات، مثل إعادة التدوير البروتين وتدهور، مستقبلات الحساسية، وناقل عصبي تحميل في الحويصلات المشبكية. يتم وصف هذا تحمض أن بوساطة ATPases بروتون، بالإضافة إلى النقل كلوريد CLC. غاية الحفاظ-البروتونات النقل electroneutral، وأعرب نا + / H + المبادلات (NHE) 6 و 7 و 9 أيضا في هذه المقصورات. وقد تم ربط الطفرات في الجينات مع الأمراض المعرفية والعصبية البشرية. ومن المفارقات، تظل أدوارهم بعيد المنال، وتوطين لهم داخل الخلايا منعت توصيف وظيفي مفصل. وتظهر هذه المخطوطة طريقة لحل هذه المشكلة. هذا يتكون من مجموعة من خطوط الخلايا الطافرة، قادرة على قيد الحياة تحمض عصاري خلوي الحاد من خلال الاحتفاظ NHEs داخل الخلايا في الغشاء البلازمي. ثم يصور اثنين من البروتوكولات المكملة لقياس الانتقائية أيون والنشاطهذه المبادلات: (ط) واحدة على أساس قياسات درجة الحموضة داخل الخلايا باستخدام المجهر مضان الفيديو، و (ثانيا) واحدة على أساس حركية سريعة الامتصاص الليثيوم. هذه البروتوكولات يمكن استقراء لقياس غيرها من شركات النقل غير كهربي. وعلاوة على ذلك، فإن الإجراء اختيار المعروضة هنا يولد خلايا مع الاحتفاظ النمط الظاهري خلل داخل الخلايا. لذلك هذه الخلايا سوف التعبير عن الأخرى أيضا بروتينات الغشاء الحويصلي على غشاء البلازما. ولذلك فإن استراتيجية التجريبية يصور هنا تشكل أداة قوية محتملة لدراسة البروتينات داخل الخلايا الأخرى التي سيتم ثم أعرب عنها في غشاء البلازما جنبا إلى جنب مع حويصلي نا + / H + المبادلات المستخدمة في اختيار.

الاختيار: ويستند اختيار H + قتل على نشر قاعدة ضعيفة الأمونيوم، كما هو مبين في الشكل 1A. وقد رائدة تأثير قواعد ضعيفة والأحماض نشر على درجة الحموضة داخل الخلايا والتر البورون والمتعاونين 22. فكرة أنيقة لاستخدام هذه الظاهرة لإنتاج تحمض قاتلة لاختيار الوراثية إيجابية ثم تم تطويرها من قبل جاك Pouysségur 17. وبموجب هذا البروتوكول، وتنخفض درجة الحموضة داخل الخلايا إلى حوالي 5.5 بعد خطوة الشطف. الخلايا التي لا تعبر عن NHE وظيفية في غشاء البلازما لا يمكن استرداد قيمة الرقم الهيدروجيني محايدة وتظهر الجانب المحمض نموذجي مع شكل مسطح والعصارة الخلوية الحبيبية (الشكل 1B). دورات الاختيار بعد تكرار (حوالي اثنين H + قتل الإجراءات / الأسبوع)، الخلايا التي بالكامل ومستقر البقاء على قيد الحياة هذا تحمض (الشكل 1C) الظهور، على تردد عن 10 -7.وسيؤدي هذا في تكوين الحيوانات المستنسخة الخلوية الفردية التي يمكن إما تتميز بشكل فردي أو المجمعة للحصول السكان الخلوي اذا شئت. ويمكن إجراء التجارب القياسية مثل biotinylation سطح الخلية أو RNA إسكات للسيطرة على أن البروتين التي أعرب عنها في غشاء البلازما هو في الواقع داخل الخلايا NHE مثل NHE7 (انظر على سبيل المثال ميلوسافليفيتش وآخرون 18). كذلك، RT-PCR والتسلسل اللاحق يجب أن يتم تنفيذ للتحقق من الطفرات في نهاية المطاف في تسلسل NHEs داخل الخلايا أعرب في خط الخلية المحددة. توصيف وظيفي: مضان Videomicroscopy: ويمكن وصف النشاط وايون الانتقائية للNHEs داخل الخلايا التي أعرب عنها في غشاء البلازما عن طريق قياس التغيرات في درجة الحموضة داخل الخلايا الناجم عن هذه NHEs في مختلف الظروف. لهذا مجموعة videomicroscopy مجهزة الإضاءة لإعدادات د الاستحواذ على الصورة schematized تحقيق ratiometric مثل BCECF / AM في الشكل 2A. الشكل 2B 2C وتبين التغيرات النمطية في القيم مضان الحصول عليها مباشرة عن الإثارات في 490 و 450 نانومتر، وذلك بعد NH 4 + تحميل التحميض. 2D الشكل يظهر منحنى درجة الحموضة تم الحصول عليها من هذه القيم مضان بعد العلاج البيانات وصفها في 2.4). الليثيوم امتصاص: جنبا إلى جنب مع الهيدروجين والصوديوم، ويضم الليثيوم جزء من العمود الأول من الجدول الدوري ولقد ثبت أن تكون الموجبة اقتران فعالة لنا + / H + المبادلات. ومن الممكن الاستفادة من هذه المعلومات لإعداد حركية سريعة الامتصاص الليثيوم، من أجل قياس في التفاصيل المعلمات الوظيفية للنا + / H + المبادلات. ولما كان هذا الموجبة هي غائبة عن السيتوبلازم الخلية، وتراكمه على CYTسوف تحمض osolic تعكس كميا النشاط من غشاء البلازما NHE. وعلاوة على ذلك، nanomolar لتركيزات بيكو مولي من الليثيوم يمكن قياسها بدقة كبيرة باستخدام مطياف الامتصاص الذري. وبالتالي، فإن هذا النهج هو قوي جدا عندما يقترن اختيار غشاء البلازما أعرب المبادلات حويصلي الشكل 3 يوضح البروتوكول قياس وصفها في 3) من قسم البروتوكولات. والمحمضة الخلايا، ويفضل أن يكون المصنف على لوحات متعددة جيدا (6 إلى 24) كما هو موضح سابقا. تبدأ الحركية مع حضانة الخلايا في المتوسط ​​يحتوي على مادة الليثيوم، والكاتيونات أو مثبطات الفائدة (الشكل 3A) الأخرى. لوقف امتصاص، ثم يتم تقديم الخلايا لأربعة يشطف سريعة في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة. تعمل بسرعة يزيل أي الليثيوم خارج الخلية مع ضمان عدم هروب رأس المال الليثيوم كبير يحدث (الشكل 3B). تركيز الليثيوم في كل بئر هو ثمتقاس باستخدام مطيافية الامتصاص الذري (الشكل 3C)، ومعدلات الأولية ليثيوم امتصاص، والتي تسفر عن مباشرة النشاط من المبادلات في الحالة المستقرة والتي يتم الحصول عليها القياسات المنحدر من دوام تراكم الليثيوم (الشكل 3D). أما بالنسبة للحركية الانزيم، الاستجابة للجرعة من المعدلات الأولية يمكن أن تستخدم لاستخلاص القيم كم لركائز (الشكل 4A) من القيم كي لمثبطات. ميزة مثيرة للاهتمام من الناقلين هي أن الكاتيونات اقتران مختلفة سوف تتنافس للنقل. هذه تعطي إمكانية قياس كم لالصوديوم المنافسة مع الليثيوم امتصاص (الشكل 4B). <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52453/52453fig1.jpg" /> الشكل 1: اختيار الخلايا إبداء داخل الخلايا نا + / H + &lt;/ قوي&gt; المبادلات في غشاء البلازما الخاصة بهم. (A) استراتيجية الخطوات الثلاث H + قتل مجموعة من الخلايا معربا عن وظيفية NHE غير تحور وغير الموسومة الخلايا في الغشاء البلازمي. (ب) المرحلة النقيض من صورة مجهرية من الخلايا الأبوية PS120 المقدمة إلى تحميل الحمضية. شريط مقياس: 25 ميكرون (C) المرحلة تباين الصورة المجهري للخلايا PS120 المختارة للتعبير عن مبادل حويصلي في غشاء البلازما، وبعد الحمل الحمضية. شريط مقياس: 25 ميكرون <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52453/52453fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52453/52453fig2.jpg" /> الشكل 2: قياسات درجة الحموضة داخل الخلايا (A) مبدأ قياس درجة الحموضة videomicroscopy. (B) E<html> volution من مضان المنبعثة (595 نانومتر) لجنة التحقيق BCECF درجة الحموضة بعد الإثارة في 490 نانومتر. L: تحميل الحمضية، ري، شطف، رد: الانتعاش، Cal6.5: المعايرة في درجة الحموضة داخل الخلايا من 6.5، Cal7.0: المعايرة في درجة الحموضة داخل الخلايا من 7.0 (C) تطور مضان المنبعثة (595 نانومتر) لجنة التحقيق BCECF درجة الحموضة بعد الإثارة في 450 نانومتر. L: تحميل الحمضية، ري، شطف، رد: الانتعاش، Cal6.5: المعايرة في درجة الحموضة داخل الخلايا من 6.5، Cal7.0: المعايرة في درجة الحموضة داخل الخلايا من 7.0 (D) تطور درجة الحموضة داخل الخلايا المحسوبة من 490/450 نسب نانومتر مضان من BCECF درجة الحموضة التحقيق ومن نقاط المعايرة. L: تحميل الحمضية، ري، شطف، رد: الانتعاش، Cal6.5: المعايرة في درجة الحموضة داخل الخلايا من 6.5، Cal7.0: المعايرة في درجة الحموضة داخل الخلايا من 7.0 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52453/52453fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> her.within صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52453/52453fig3.jpg" /> الرقم 3: النشاط NHE تقاس بنسب الأولية لللي + امتصاص (A - C) التي تصور الخطوات الحاسمة مختلفة من تقنية القياس (D) مثال من دورة الوقت يقاس من امتصاص الليثيوم لحويصلي NHE7 مبادل مخطط أعرب في البلازما الغشاء. لاحظ الخطي من الحركية ضمن الشروط التجريبية، وضمان قياس معدلات الأولية. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52453/52453fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/52453/52453fig4.jpg" /> الشكل 4: نموذجي منحنيات الجرعة والاستجابة لNHE7 (البيانات الأصلية من 18).معدلات الأولية ليثيوم امتصاص تم قياسها باستخدام حركية-1 دقيقة. (A) منحنى الجرعة والاستجابة ليثيوم خارج الخلية. (B) مسابقة تركيزات مختلفة من الصوديوم خارج الخلية على امتصاص 1MM الليثيوم خارج الخلية. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52453/52453fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane at JoVE.c

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

توصيف وظيفي نا<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; المبادلات بين الخلايا من المقصورات عن طريق بروتون-مما أسفر عن مقتل اختيار للتعبير عنها في غشاء البلازما

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

functional-characterization-na-h-exchangers-intracellular

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

9.2K Views.  Université Nice-Sophia Antipolis, Laboratoire de Physiomédecine Moléculaire, CNRS UMR7370, and Laboratories of Excellence Ion Channel Science and Therapeutics. The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers. 

Video: Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM c-Cyts) has recently emerged as a novel whole-cell analytical method to characterize the bacterial electron transport from the respiratory chain to the cell exterior, referred to as the extracellular electron transport (EET). While the pathway and kinetics of the electron flow during the EET reaction have been investigated, a whole-cell electrochemical method to examine the impact of cation transport associated with EET has not yet been established. In the present study, an example of a biochemical technique to examine the deuterium kinetic isotope effect (KIE) on EET through OM c-Cyts using a model microbe, Shewanella oneidensis MR-1, is described. The KIE on the EET process can be obtained if the EET through OM c-Cyts acts as the rate-limiting step in the microbial current production. To that end, before the addition of D2O, the supernatant solution was replaced with fresh media containing a sufficient amount of the electron donor to support the rate of upstream metabolic reactions, and to remove the planktonic cells from a uniform monolayer biofilm on the working electrode. Alternative methods to confirm the rate-limiting step in microbial current production as EET through OM c-Cyts are also described. Our technique of a whole-cell electrochemical assay for investigating proton transport kinetics can be applied to other electroactive microbial strains.

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Here we present a protocol of whole-cell electrochemical experiments to study the contribution of proton transport to the rate of extracellular electron transport via the outer-membrane cytochromes complex in Shewanella oneidensis MR-1.

الكهروكيميائية "الكشف من الديوتريوم الحركية النظائر تأثير النقل الإلكترون خارج الخلية" في أونيدينسيس شيوانيلا السيد-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Biochemistry

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. This method combines expression of proteins tagged with the fluorescent non-canonical amino acid ANAP, and FRET between ANAP and fluorescent (trinitrophenyl) nucleotide derivatives. We present examples of nucleotide binding to ANAP-tagged KATP ion channels measured in unroofed plasma membranes and excised, inside-out membrane patches under voltage clamp. The latter allows for simultaneous measurements of ligand binding and channel current, a direct readout of protein function. Data treatment and analysis are discussed extensively, along with potential pitfalls and artefacts. This method provides rich mechanistic insights into the ligand-dependent gating of KATP channels and can readily be adapted to the study of other nucleotide-regulated proteins or any receptor for which a suitable fluorescent ligand can be identified.

This protocol presents a method for measuring adenine nucleotide binding to receptors in real time in a cellular environment. Binding is measured as F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between trinitrophenyl nucleotide derivatives and protein labeled with a non-canonical, fluorescent amino acid.

قياس ارتباط النوكليوتيدات ببروتينات الغشاء الوظيفية السليمة في الوقت الفعلي

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as tools for developing clinical therapies, many of which depend on the inhibition of membrane proteins such as transporters. However, most of the methods used to determine the inhibition of transport activity are difficult to perform in high-throughput routines and depend on labeled substrates availability thereby complicating the screening of large nanobody libraries. Solid-supported membrane (SSM) electrophysiology is a high-throughput method, used for characterizing electrogenic transporters and measuring their transport kinetics and inhibition. Here we show the implementation of SSM-based electrophysiology to select inhibitory and non-inhibitory nanobodies targeting an electrogenic secondary transporter and to calculate nanobodies inhibitory constants. This technique may be especially useful for selecting inhibitory nanobodies targeting transporters for which labeled substrates are not available.

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane SSM-Based Electrophysiology

Nanobodies are important tools in structural biology and pose a great potential for the development of therapies. However, the selection of nanobodies with inhibitory properties can be challenging. Here we demonstrate the use of solid-supported-membrane (SSM)-based electrophysiology for the classification of inhibitory and non-inhibitory nanobodies targeting electrogenic membrane transporters.

اختيار الأجسام النانوية المثبطة المستهدفة بالناقل بواسطة الغشاء الصلب المدعوم (SSM) القائم على الفيزيولوجيا الكهربية

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

الطفرات والتحليل الوظيفي للقنوات ايون أعربت Heterologously في خلايا الثدييات

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into portions attributable to each channel type. This study demonstrates how impedance spectroscopy may be used to identify specific frequencies that highly correlate with the steady state current amplitude measured during voltage clamp experiments. The method involves inserting a noise function containing specific frequencies into the voltage step protocol. In the work presented, a model cell is used to demonstrate that no high correlations are introduced by the voltage clamp circuitry, and also that the noise function itself does not introduce any high correlations when no ion channels are present. This validation is necessary before the technique can be applied to preparations containing ion channels. The purpose of the protocol presented is to demonstrate how to characterize the frequency response of a single ion channel type to a noise function. Once specific frequencies have been identified in an individual channel type, they can be used to reproduce the steady state current voltage (IV) curve. Frequencies that highly correlate with one channel type and minimally correlate with other channel types may then be used to estimate the current contribution of multiple channel types measured simultaneously.
METHODS: Voltage clamp measurements were performed on a model cell using a standard voltage step protocol (-150 to +50 mV, 5mV steps). Noise functions containing equal magnitudes of 1-15 kHz frequencies (zero to peak amplitudes: 50 or 100mV) were inserted into each voltage step. The real component of the Fast Fourier transform (FFT) of the output signal was calculated with and without noise for each step potential. The magnitude of each frequency as a function of voltage step was correlated with the current amplitude at the corresponding voltages.
RESULTS AND CONCLUSIONS: In the absence of noise (control), magnitudes of all frequencies except the DC component correlated poorly (|R|&lt;0.5) with the IV curve, whereas the DC component had a correlation coefficient greater than 0.999 in all measurements. The quality of correlation between individual frequencies and the IV curve did not change when a noise function was added to the voltage step protocol. Likewise, increasing the amplitude of the noise function also did not increase the correlation. Control measurements demonstrate that the voltage clamp circuitry by itself does not cause any frequencies above 0 Hz to highly correlate with the steady-state IV curve. Likewise, measurements in the presence of the noise function demonstrate that the noise function does not cause any frequencies above 0 Hz to correlate with the steady-state IV curve when no ion channels are present. Based on this verification, the method can now be applied to preparations containing a single ion channel type with the intent of identifying frequencies whose amplitudes correlate specifically with that channel type.

There are technical obstacles to measuring current flux through multiple ion channels simultaneously, and later discerning what portion of the transmembrane current is due to each channel type. To address this need, this method presents a way to generate the IV curve of individual channel types using specific frequency components.

خلاصة من المنحنى الرابع ايون القناة باستخدام مكونات التردد

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.

كامل خلية التصحيح المشبك تسجيلات لتحديد الكهربية من أيون الانتقائية في تشانلرودوبسينز

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Neuroscience

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

قياس الكاتيونات النقل من نا، K-H و، K-أتباز في<em&gt; القيطم</em&gt; البويضات بواسطة الامتصاص الذري الطيفي: بديل لفحوصات النظائر المشعة

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined lipid composition. We are studying the lipid-dependent gating effects in a prototype voltage-gated potassium (Kv) channel, and have worked out detailed procedures to reconstitute the channels into different membrane systems. Our reconstitution procedures take consideration of both detergent-induced fusion of vesicles and the fusion of protein/detergent micelles with the lipid/detergent mixed micelles as well as the importance of reaching an equilibrium distribution of lipids among the protein/detergent/lipid and the detergent/lipid mixed micelles. Our data suggested that the insertion of the channels in the lipid vesicles is relatively random in orientations, and the reconstitution efficiency is so high that no detectable protein aggregates were seen in fractionation experiments. We have utilized the reconstituted channels to determine the conformational states of the channels in different lipids, record electrical activities of a small number of channels incorporated in planar lipid bilayers, screen for conformation-specific ligands from a phage-displayed peptide library, and support the growth of 2D crystals of the channels in membranes. The reconstitution procedures described here may be adapted for studying other membrane proteins in lipid bilayers, especially for the investigation of the lipid effects on the eukaryotic voltage-gated ion channels.

Procedures for complete reconstitution of a prototype voltage-gated potassium channel into lipid membranes are described. The reconstituted channels are suitable for biochemical assays, electrical recordings, ligand screening and electron crystallographic studies. These methods may have general applications to the structural and functional studies of other membrane proteins.

إعادة تشكيل قناة كيلو فولت في الأغشية الدهنية للدراسات الهيكلية والوظيفية

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. These transport mechanisms are mediated by the activities of specialized transporter proteins. Specifically,pH dynamics are finely controlled by plasma membrane proton (H+) extrusion systems, such as the Na+/H+ exchanger (NHE) protein family. Despite extensive efforts to study the mechanisms underlying NHE regulation, our current understanding of the biophysical and molecular properties of the NHE family is inadequate because of the limited availability of methods to effectively measure NHE activity. In this manuscript, we used H+-selective electrodes during whole-cell patch clamping recording to measure NHE-induced H+ flux. We proposed this approach to overcome some limitations of typically used methods to measure NHE activity, such as radioactive uptake and fluorescent membrane permeants. Measurement of NHE activity using the described method enables high sensitivity and time resolution and more efficient control of intracellular H+ concentrations. H+-selective electrodes are based on the fact that transporter activity creates an ion gradient in close proximity to the cell membrane. An H+-selective electrode moving up to and away from the cell membrane in a repetitive, oscillatory fashion records a voltage difference that is dependent on H+ flux. While H+-selective electrodes are used to detect H+ flux moving out of the cell, the patch clamp method in the whole-cell configuration is used to control the intracellular ion composition. Moreover, application of the giant patch clamp technique allows modification of the intracellular composition of not only ions but also lipids. The transporter activity of NHE isoform 3 (NHE3) was measured using this technical approach to study the molecular basis of NHE3 regulation by phosphoinositides.

This manuscript describes the applications of proton-selective electrodes and patch clamping methods to measure the activity of proton transport systems. These methods overcome some limitations of techniques commonly used to study proton transport activity, such as moderate sensitivity, time resolution and insufficient intracellular milieu control.

تطبيق القياس الكهربية لدراسة نشاط الناقلين محايدة الكهربائية

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

Ion Exchange

Ion exchange chromatography separates charged molecules from a solution by reversibly exchanging them with mobile, or &#39;active&#39;, ions associated with the oppositely charged stationary phase. This method can be used to separate ions, soften and deionize water, and purify solutions. The polymers comprising the ion-exchange column are high-molecular-weight and chemically stable polymers, crosslinked to be porous and essentially insoluble. They are also functionalized with either acidic or basic groups. When functionalized with acidic groups, the columns or resin are known as cation exchangers and contain negatively charged polymers with positive counter ions. These allow cations to be exchanged from the mobile phase. When functionalized with basic groups, the columns or resin are known as anion exchangers, which contain positively charged polymers with negative counter ions and exchange anions from the solution.
During ion exchange, the counterions associated with the solid-phase polymers enter the solution while ions from the solution interact with the polymer in their place. Note that the ability to exchange ions increases as the extent of cross-linking increases and the number of ion-exchange groups increases in the polymer. This exchange is reversible and continues until equilibrium is established.
Acid cation exchangers can be functionalized with either strong acids, such as sulfonic acid (&#8722;SO3H), seen in polystyrene sulfonic acid, or weak acids, such as carboxylic acid (&#8722;COOH), seen in poly(methyl methylacrylic) acid. Similarly, anion exchangers are classified as either strong or weak. Strong anion exchangers often contain quaternary ammonium groups (&#8722;CH2N(CH3)3+), such as those in polystyrene quaternary ammonium chloride, and weak anion exchangers are often functionalized with substituted amines (&#8722;NH3+), such as those in polystyrene tertiary amine hydroxide.

توصيف وظيفي نا

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video