Name: quantitative immunofluorescence assay to measure the variation in protein levels at centrosomes
Uploaded: 2014-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes at JoVE.com

This work was supported by a National Institutes of Health grant (GM77311) and a seed grant from The Ohio Cancer Research Associates (to H.A.F.). SM was partially supported by an Up on the Roof fellowship from the Human Cancer Genetics Program of The Ohio State University Comprehensive Cancer Center.

<ol>
	<li>Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+linking+extra+centrosomes+to+chromosomal+instability.">A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability.</a> Nature. 460, 278-282 (2009).</li><li>Kobayashi, T., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulating+the+transition+from+centriole+to+basal+body.">Regulating the transition from centriole to basal body.</a> J. Cell Biol. 193, 435-444 (2011).</li><li>Azimzadeh, J., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+centriole.">Building the centriole.</a> Curr. Biol. 20, 816-825 (2010).</li><li>Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAS-6+is+a+cartwheel+protein+that+establishes+the+9-fold+symmetry+of+the+centriole.">SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole.</a> Curr. Biol. 17, 2169-2174 (2007).</li><li>Strnad, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+HsSAS-6+levels+ensure+formation+of+a+single+procentriole+per+centriole+during+the+centrosome+duplication+cycle.">Regulated HsSAS-6 levels ensure formation of a single procentriole per centriole during the centrosome duplication cycle.</a> Dev. Cell. 13, 203-213 (2007).</li><li>Hilbert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+centriolar+protein+SAS-6+forms+a+spiral+that+is+consistent+with+imparting+a+ninefold+symmetry.">Caenorhabditis elegans centriolar protein SAS-6 forms a spiral that is consistent with imparting a ninefold symmetry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 11373-11378 (2013).</li><li>Pike, A. N., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centriole+assembly+and+the+role+of+Mps1:+defensible+or+dispensable.">Centriole assembly and the role of Mps1: defensible or dispensable.</a> Cell Div. 6, 9 (2011).</li><li>Haren, L., Stearns, T., Luders, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plk1-dependent+recruitment+of+gamma-tubulin+complexes+to+mitotic+centrosomes+involves+multiple+PCM+components.">Plk1-dependent recruitment of gamma-tubulin complexes to mitotic centrosomes involves multiple PCM components.</a> PLoS One. 4, e5976 (2009).</li><li>Andersen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+the+human+centrosome+by+protein+correlation+profiling.">Proteomic characterization of the human centrosome by protein correlation profiling.</a> Nature. 426, 570-574 (2003).</li><li>Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+isolated+chlamydomonas+centrioles+reveals+orthologs+of+ciliary-disease+genes.">Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes.</a> Curr. Biol. 15, 1090-1098 (2005).</li><li>Kumar, A., Rajendran, V., Sethumadhavan, R., Purohit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEP+proteins:+the+knights+of+centrosome+dynasty.">CEP proteins: the knights of centrosome dynasty.</a> Protoplasma. 250, 965-983 (2013).</li><li>Kanai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+functional+interaction+between+mortalin+and+Mps1+kinase.">Physical and functional interaction between mortalin and Mps1 kinase.</a> Genes Cells. 12, 797-810 (2007).</li><li>Jakobsen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+asymmetrically+localizing+components+of+human+centrosomes+identified+by+complementary+proteomics+methods.">Novel asymmetrically localizing components of human centrosomes identified by complementary proteomics methods.</a> Embo. J. 30, 1520-1535 (2011).</li><li>Sang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+NPHP-JBTS-MKS+protein+network+reveals+ciliopathy+disease+genes+and+pathways.">Mapping the NPHP-JBTS-MKS protein network reveals ciliopathy disease genes and pathways.</a> Cell. 145, 513-528 (2011).</li><li>Dowdle, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+a+ciliary+B9+protein+complex+causes+Meckel+syndrome.">Disruption of a ciliary B9 protein complex causes Meckel syndrome.</a> Am. J. Hum. Genet. 89, 94-110 (2011).</li><li>Majumder, S., Slabodnick, M., Pike, A., Marquardt, J., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VDAC3+regulates+centriole+assembly+by+targeting+Mps1+to+centrosomes.">VDAC3 regulates centriole assembly by targeting Mps1 to centrosomes.</a> Cell Cycle. 11, 3666-3678 (2012).</li><li>Guderian, G., Westendorf, J., Uldschmid, A., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plk4+trans-autophosphorylation+regulates+centriole+number+by+controlling+betaTrCP-mediated+degradation.">Plk4 trans-autophosphorylation regulates centriole number by controlling betaTrCP-mediated degradation.</a> J. Cell Sci. 123, 2163-2169 (2010).</li><li>Holland, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autoregulated+instability+of+Polo-like+kinase+4+limits+centrosome+duplication+to+once+per+cell+cycle.">The autoregulated instability of Polo-like kinase 4 limits centrosome duplication to once per cell cycle.</a> Genes Dev. 26, 2684-2689 (2012).</li><li>Kasbek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+the+degradation+of+mps1+at+centrosomes+is+sufficient+to+cause+centrosome+reduplication+in+human+cells.">Preventing the degradation of mps1 at centrosomes is sufficient to cause centrosome reduplication in human cells.</a> Mol. Biol. Cell. 18, 4457-4469 (2007).</li><li>Kasbek, C., Yang, C. H., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antizyme+restrains+centrosome+amplification+by+regulating+the+accumulation+of+Mps1+at+centrosomes.">Antizyme restrains centrosome amplification by regulating the accumulation of Mps1 at centrosomes.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 3878-3889 (2010).</li><li>Puklowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SCF-FBXW5+E3-ubiquitin+ligase+is+regulated+by+PLK4+and+targets+HsSAS-6+to+control+centrosome+duplication.">The SCF-FBXW5 E3-ubiquitin ligase is regulated by PLK4 and targets HsSAS-6 to control centrosome duplication.</a> Nat. Cell Biol. 13, 1004-1009 (2011).</li><li>Spektor, A., Tsang, W. Y., Khoo, D., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cep97+and+CP110+suppress+a+cilia+assembly+program.">Cep97 and CP110 suppress a cilia assembly program.</a> Cell. 130, 678-690 (2007).</li><li>Salisbury, J., Suino, K., Busby, R., Springett, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrin-2+is+required+for+centriole+duplication+in+Mammalian+cells.">Centrin-2 is required for centriole duplication in Mammalian cells.</a> Curr. Biol. 12, 1287 (2002).</li><li>Lukasiewicz, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+centrin+stability+by+Aurora+A.">Control of centrin stability by Aurora A.</a> PLoS One. 6, e21291 (2011).</li><li>Zhao, J., Ren, Y., Jiang, Q., Feng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkin+is+recruited+to+the+centrosome+in+response+to+inhibition+of+proteasomes.">Parkin is recruited to the centrosome in response to inhibition of proteasomes.</a> J. Cell Sci. 116, 4011-4019 (2003).</li><li>Korzeniewski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cullin+1+functions+as+a+centrosomal+suppressor+of+centriole+multiplication+by+regulating+polo-like+kinase+4+protein+levels.">Cullin 1 functions as a centrosomal suppressor of centriole multiplication by regulating polo-like kinase 4 protein levels.</a> Cancer Res. 69, 6668-6675 (2009).</li><li>Rohatgi, R., Milenkovic, L., Corcoran, R. B., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signal+transduction+by+Smoothened:+pharmacologic+evidence+for+a+2-step+activation+process.">Hedgehog signal transduction by Smoothened: pharmacologic evidence for a 2-step activation process.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3196-3201 (2009).</li><li>Majumder, S., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VDAC3+and+Mps1+negatively+regulate+ciliogenesis.">VDAC3 and Mps1 negatively regulate ciliogenesis.</a> Cell Cycle. 12, 849-858 (2013).</li><li>Howell, B. J., Hoffman, D. B., Fang, G., Murray, A. W., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Mad2+dynamics+at+kinetochores,+along+spindle+fibers,+and+at+spindle+poles+in+living+cells.">Visualization of Mad2 dynamics at kinetochores, along spindle fibers, and at spindle poles in living cells.</a> J. Cell Biol. 150, 1233-1250 (2000).</li><li>Meraldi, P., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+cohesion+is+regulated+by+a+balance+of+kinase+and+phosphatase+activities.">Centrosome cohesion is regulated by a balance of kinase and phosphatase activities.</a> J. Cell Sci. 114, 3749-3757 (2001).</li><li>Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis-specific+anchoring+of+gamma+tubulin+complexes+by+pericentrin+controls+spindle+organization+and+mitotic+entry.">Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 3642-3657 (2004).</li><li>Lee, K., Rhee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLK1+phosphorylation+of+pericentrin+initiates+centrosome+maturation+at+the+onset+of+mitosis.">PLK1 phosphorylation of pericentrin initiates centrosome maturation at the onset of mitosis.</a> J. Cell Biol. 195, 1093-1101 (2011).</li><li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microcephaly+protein+CEP135+binds+to+hSAS-6+and+CPAP,+and+is+required+for+centriole+assembly.">Human microcephaly protein CEP135 binds to hSAS-6 and CPAP, and is required for centriole assembly.</a> Embo. J. 32, 1141-1154 (2013).</li><li>Lichtenstein, N., Geiger, B., Kam, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+cytoskeletal+organization+by+digital+fluorescent+microscopy.">Quantitative analysis of cytoskeletal organization by digital fluorescent microscopy.</a> Cytometry A. 54, 8-18 (2003).</li><li>Keller, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+centriole+proteome:+the+conserved+WD40+domain+protein+POC1+is+required+for+centriole+duplication+and+length+control.">Molecular architecture of the centriole proteome: the conserved WD40 domain protein POC1 is required for centriole duplication and length control.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 1150-1166 (2009).</li><li>Venoux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poc1A+and+Poc1B+act+together+in+human+cells+to+ensure+centriole+integrity.">Poc1A and Poc1B act together in human cells to ensure centriole integrity.</a> J. Cell Sci. 126, 163-175 (2013).</li><li>Stevens, N. R., Roque, H., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DSas-6+and+Ana2+coassemble+into+tubules+to+promote+centriole+duplication+and+engagement.">DSas-6 and Ana2 coassemble into tubules to promote centriole duplication and engagement.</a> Dev. Cell. 19, 913-919 (2010).</li><li>Machiels, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+analysis+of+cell+cycle+kinetics+upon+proteasome+inhibition.">Detailed analysis of cell cycle kinetics upon proteasome inhibition.</a> Cytometry. 28, 243-252 (1997).</li><li>Yang, C. H., Kasbek, C., Majumder, S., Yusof, A. M., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mps1+phosphorylation+sites+regulate+the+function+of+centrin+2+in+centriole+assembly.">Mps1 phosphorylation sites regulate the function of centrin 2 in centriole assembly.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 4361-4372 (2010).</li><li>Tsou, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polo+kinase+and+separase+regulate+the+mitotic+licensing+of+centriole+duplication+in+human+cells.">Polo kinase and separase regulate the mitotic licensing of centriole duplication in human cells.</a> Dev. Cell. 17, 344-354 (2009).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li><li>Buck, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+S-phase+cell+cycle+progression+using+5-ethynyl-2'-deoxyuridine+incorporation+with+click+chemistry,+an+alternative+to+using+5-bromo-2'-deoxyuridine+antibodies.">Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies.</a> Biotechniques. 44, 927-929 (2008).</li><li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy.">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> J. Cell Biol. 185, 1135-1148 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

المجهر الكمي في بيولوجيا الخلية ويرتبط عادة مع فحوصات التصوير الخلية الحية، مثل نقل الإسفار الرنين الطاقة (الحنق)، الإسفار الانتعاش بعد photobleaching من (FRAP)، وما إلى ذلك، هناك أمثلة متزايد من علماء الأحياء الخلايا نامية مختلفة المقايسات المجهري الكمية لثابت الخلايا في السنوات الأخيرة 27،34-36. الأهم من ذلك، التقدم في فهم البيولوجيا الجسيم المركزي وغالبا ما يتطلب فهم وظيفة الجسيم المركزي محددة من البروتينات التي يمكن تنظيمها بشكل مختلف عن غيرها من أحواض حمامات centrosomal. وهكذا، قمنا بتطوير معهد التمويل الدولي الفحص الكمي لتحليل تحديدا على مستوى centrosomal النسبي للبروتين في عينتين تعامل بشكل مختلف. لأن هذا يتطلب أن الخلايا يتم إصلاحها ومعالجتها coverslips على منفصلة، ​​وبالتالي فإننا أدخلت معيارا الداخلي لغرض التطبيع، لتحسين السيطرة عن القطع الأثرية محتملة، بسبب ضرورة التعامل مع experime اثنينالسكان الخلية ntal على حدة، وزيادة دقة الفحص. لا يوجد سوى عدد قليل من الدراسات السابقة 37 التي استخدمت هذا المعيار الداخلي لقياس كثافة مضان النسبية للبروتين الاختبار. حين اختيار معيار الداخلي هو أمر حاسم لدقة فحص لدينا، فإنه يمكن القول إن الجانب الأكثر تحديا. من الناحية المثالية، التكرارات زوج مريكز خلال S-المرحلة، وcentrioles المكررة ثم تتراكم مكونات PCM إضافية بما في ذلك γ تويولين خلال G2 ذلك أن اثنين من centrosomes الناضجة يمكن أن تصبح أقطاب المغزل الإنقسامية. ولذلك، فإننا نفترض أن مستوى centrosomal من γ تويولين لن تتغير بشكل ملحوظ في الخلايا التي هي بدقة وS-المرحلة. ويبدو أن هذا هو الحال في خلايا RPE1 حيث يتم وضع علامة خلايا S-المرحلة قبل وضع العلامات BrdU وجيزة. ومع ذلك، يجب أن يتم اختبار صلاحية معيار الداخلي لكل نوع من الخلايا وحالة تجريبية. على سبيل المثال، في حين أن خلفية-كورزادت المديرية التنفيذية VDAC3 مضان أكثر من اثنين أضعاف ردا على proteasome وتثبيط في aphidicolin المعالجة (S-المرحلة اعتقلت) U2OS الخلايا، كان هناك أيضا (0.001 &lt;P-قيمة &lt;0.05) زيادة صغيرة ولكن ذات دلالة إحصائية في centrosomal γ تويولين (التكميلية الشكل). وهكذا، γ تويولين ليست دائما على الرقابة الداخلية الملائمة، حتى بالنسبة للخلايا التي يتم القبض عليه في دورة الخلية. وعلى غرار كل معهد التمويل الدولي المجهري الفحص الآخر، واحدة من عيوب هذا الاختبار هو أن الأجسام المضادة ضد البروتين الاختبار والمعيار الداخلي يجب أن تثار في الأنواع المضيفة مختلفة. في حين أن البيانات تشير الى أن Cep135 هو المعيار الداخلي أفضل من Sas6، لم نتمكن من تطبيع مستويات VDAC3 ضد Cep135 مثل الأجسام المضادة المتاحة ضد هذه البروتينات كان كلا أثيرت في الأرنب. وبالتالي، فإننا بدلا تطبيع ضد Sas6، الذي تسبب في المبالغة في تقدير الانخفاض في مستويات VDAC3 بين أواخر S-مرحلة وG2. في الحالة التي تكون فيها الأسواق العالمية ضغطهامعيار rnal يختلف متواضعة، يمكن للمرء أن إدخال عامل التطبيع آخر لحساب هذا الاختلاف. على سبيل المثال، لتصحيح التباين في Sas6، ضربنا كثافة VDAC3 Sas6-تطبيع من شدة Sas6 Cep135 تطبيع. في الحالات التي يكون فيها اختيار المعيار الداخلي المناسب أمر صعب، قد صبغة الفلورسنت المجهرية المغلفة (0،02-0،04 ميكرون قطر) توفر استراتيجية بديلة. إشارة من المكروية مضان الحالي في نفس المجال مثل خلية من الفائدة يمكن استخدامها لتطبيع إشارة مضان المقابلة لبروتين من الفائدة. من ناحية أخرى، إذا كان يتم تصوير الاختبار ومراقبة الخلايا معا، واحدة قد لا تحتاج مثل هذا المعيار الداخلي للتطبيع. لقد استخدمت سابقا نسخة من هذا الاختبار لمقارنة مستوى centrosomal من Mps1 في الخلايا overexpressing إما السيكلين و19 أو 20 مضاد الإنزيم، التي إما منع 19 أو 20 لتعزيز degradation من Mps1 في centrosomes، على التوالي، لأنه في خلايا untransfected المجاورة تصويرها في نفس الوقت. من أجل دراسة تأثير VDAC3 centrosomal على proteasome وكبت، كنا وضع العلامات BrdU لتحديد ومقارنة الخلايا التي هي في S-المرحلة. بينما العلاج MG115 قد تحول دون تقدم دورة الخلية، وهذا تثبيط يتطلب أعلى بكثير تركيز 38 من تلك المستخدمة في هذه الدراسة. في التراكيز المستخدمة هنا MG115 يمكن منع نقاط التفتيش دورة الخلية والتحولات، ولكن لا يمنع تقدم دورة الخلية. ومع ذلك، يجب التحقق من كل نوع من الخلايا، كما فعلنا هنا من خلال إظهار أن MG115 لم يغير النسبة المئوية للخلايا إيجابية BrdU مقارنة DMSO. ومع ذلك، إلقاء القبض على الخلايا في S-المرحلة باستخدام aphidicolin أو هيدروكسي يوريا (HU) أو مزامنة الخلايا باستخدام الإنقسامية &quot;يهز حالا&quot; والافراج أو يمكن استخدام مزدوج كتلة ثيميدين وإطلاق مع اقتراب بديلة لتوليد شعبية يعادلستعقد من الخلايا في S-المرحلة. فإن استراتيجية نبض مطاردة BrdU لدراسة نقاط زمنية دورة الخلية تكون مفيدة جدا في العديد من المقايسات الفنية التي تتطلب دورة الخلية رابط الجأش. هذا هو مقايسة بيولوجيا أكثر أهمية التي قد تكون قادرة على استبدال التقنيات اعتقال دورة الخلية باستخدام مختلف مثبطات دورة الخلية. استخدام هذه المثبطات قد غالبا ما تسبب أنواع مختلفة من الإجهاد الفسيولوجية في الخلايا مما يؤدي إلى تغيرات شاذة في الظواهر دورة الخلية. استخدام نهج نبض مطاردة مكننا من إثبات أن استنزاف Cetn2 تأخير فقط التجمع مريكز 39 بدلا من التسبب في كتلة كاملة على النحو الذي اقترحه الدراسات السابقة 23. الكشف عن خلايا BrdU إيجابي يتطلب التحلل الحامض من العينات. نحن وكثير من الباحثين الآخرين يستخدمون الاسلوب الذي إعادة إصلاح الخلايا بعد تلطيخ الابتدائي والثانوي للبروتينات اختبار، قبل التحلل الحمضي، مع خسارة ضئيلة من شدة تلطيخ للمختلفار البروتينات الجسيم المركزي 40. ومع ذلك، يمكن أن يكون بديلا محتملا لاستخدام 5-إيثينيل-2&#39;-deoxyuridine (EDU)، وآخر التناظرية ثيميدين هذا هو، على غرار BrdU، أدرجت كفاءة في تكرار DNA 41. التصور من ايدو باستخدام &#39;انقر الكيمياء &quot;لا يتطلب التحلل الحامض 42، ويجوز لها بالتالي أكثر ملاءمة لبعض الأجسام المضادة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن لهذا الفحص بسهولة أن تستخدم لقياس التغير في التعديلات بعد متعدية من بروتين معين في centrosomes. على سبيل المثال، فإن مستوى centrosomal من الفسفرة يمكن تطبيع ضد المستوى الإجمالي من البروتين نفسه، شريطة أن الأجسام المضادة في مواقع محددة الفسفرة موجودة. ويمكن تطبيق هذا الاختبار على الفور لتقييم المستويات النسبية للالفسفرة بين ظروف تجريبية أو مراحل دورة الخلية، ولكن من المحتمل أن تتكيف مع تقييم المستويات الإجمالية من الفسفرة إذا المعلمات الحرجة من الأجسام المضادة affinومن المعروف ities أو يمكن تحديده. وينبغي أيضا أن يكون هذا الاختبار للتطبيق لدراسة البروتينات في أي موقع آخر في الخلايا، على الرغم من أن المنطقة ذات الاهتمام يجب أن لا تكون كبيرة جدا. سوف مقايسة تكون مفيدة بشكل خاص لقياس تعديل موقع معين من البروتين الذي يكون موضعيا في مواقع الخلوية متعددة. وهناك عدد قليل من المعايير الفنية مثل photobleaching من التفاضلية، وتأثير التصوير الرقمي، والخطي من شدة مضان من fluorophores، والضوضاء الخلفية الخ التي يجب أن تؤخذ في الاعتبار لتحقيق أقصى قدر من الدقة في قياس 43. على سبيل المثال، يمكن للمرء تبديل تألقي المرتبطة بكل الضد الثانوية لتقييم مساهمة photobleaching من. العديد من المعالم الأخرى يمكن التحكم بشكل جيد إذا واحد يستخدم ظروف مماثلة التصوير (زمن التعرض، وزيادة حجم خطوة، وعدد من Z-مداخن، الخ) ونفس برامج التصوير في كل شوط التصوير. على الرغم من أننا المستخدمةالخوارزمية لا الجار طوال فحص لدينا لأداء صورة إزالة التفاف، وهذا الفحص يمكن دمجها مع الخوارزمية إزالة التفاف أخرى مثل مقيدة تكرارية. ونلاحظ أيضا أنه ينبغي أن يكون من السهل على التكيف مع هذا الاختبار إلى أي عدد من مختلف حزم البرمجيات والتصوير، لأن معظم المتاحة عموما برمجيات تحليل الصور ديه أدوات لتحليل كثافة مضان والمسافات. وينبغي أن يكون هذا الاختبار ينطبق على أي نوع من الخلايا، وخيارنا الخلايا هنا يستند بحتة على أهميتها في مجال البحوث البيولوجيا الجسيم المركزي، واستخدامها في امتحاناتنا السابقة من centrosomal وظيفة VDAC3 16،28. ومع ذلك، فإن صلاحية المعايير الداخلية والأوقات المناسبة لنبض مطاردة لتحديد الخلايا في S-المرحلة، G2، أو الانقسام يجب أن تحدد لكل نوع من الخلايا. وعموما، سيكون لدينا وضعت حديثا تقنية مضان الكمية في تركيبة مع BrdU نبض مطاردة فحص تكون وسيلة مفيدة جدا لحل العديد معقدةآليات في علم الأحياء الجسيم المركزي وفي كثير من الجوانب الأوسع لبيولوجيا الخلية.

تتكون Centrosomes من زوج من centrioles محاطة المواد محيط بالمريكز (PCM). يجري المراكز الرئيسية أنيبيب المنظمة (MTOCs) في خلايا الثدييات، centrosomes بمثابة قطبي مغزل الإنقسامية في تقسيم الخلايا، وبالتالي تساعد على الحفاظ على سلامة الجينوم 1. في الخلايا هادئة (على سبيل المثال، خلال مرحلة G0)، واحد من اثنين من centrioles من الجسيم المركزي، وهي مريكز الأم، وتحويلها إلى هيئة القاعدية لتجميع هدب الابتدائي، عضية الحسية جاحظ الخروج من سطح الخلية 2. مرة واحدة الخلايا إعادة إدخال دورة الخلية، ويتم تفكيكها أهداب الابتدائي وكل مريكز يوجه التجمع من طليعة المريكز في نهايته القريبة أن يستطيل تدريجيا لتشكيل مريكز ناضجة 3. في بداية S-المرحلة، يتم تشكيل بنية تشبه عجلة العربة التي توفر التماثل 9 أضعاف إلى مريكز على سطح كل مريكز القائمة وسوف تصبح قاعدة كل طليعة المريكز. Sas6 رقبعة أمر لا غنى عنه ليتم تجنيده التجمع مريكز لتشكيل محور عجلة العربة 4-6. ثم يتم تجميع البروتينات مريكزي أخرى على عجلة العربة في درجة عالية من التنظيم، الأقرب إلى الطريقة البعيدة 7. بعد الانتهاء بالضبط الازدواجية مريكز، وخلايا تجميع المواد محيط بالمريكز إضافية لبناء اثنين centrosomes وظيفية بحلول نهاية المرحلة G2 8. وبالإضافة إلى المكونات الأساسية مريكزي 9-11، والعديد من البروتينات الأخرى بما في ذلك تحركات، الفسفاتازات، مرافقين، مكونات سقالة، غشاء البروتينات المرتبطة بها والآلات تدهور ترتبط مع centrioles والهيئات القاعدية وPCM في أوقات مختلفة من دورة الخلية 12-16. ويلاحظ في كثير من الأحيان أن مستويات centrosomal من العديد من البروتينات تنظم زمنيا من قبل آليات الاستهداف centrosomal و / أو تدهور proteasomal في centrosomes. الأهم من ذلك أن التقلبات في مستوى centrosomal من عدة بروتينات مثل Plk4، Mps1، Sas6، وCP110 لنقاط ر مختلفة من دورة الخلية ويبدو أن تكون حاسمة لتنظيم التجمع مريكز 5،17-22، وفي حالة Mps1 منع هذا التدهور centrosomal يؤدي إلى تشكيل centrioles الزائدة 19. من ناحية أخرى، فإن الكسور centrosomal من عدة بروتينات أقل عطوب بالمقارنة مع حمامات عصاري خلوي. على سبيل المثال سيرنا بوساطة أسفل تنظيم Centrin 2 (Cetn2) أدى إلى سوى انخفاض معتدل من مستوى البروتين في centrioles على الرغم من انخفاض كبير في مستوياته خلية كاملة 23. ولذا فمن الأهمية بمكان لقياس التغيرات في مستوى البروتينات centrosomal في الجسيم المركزي بدلا من قياس مستويات البروتين خلية كاملة عند تقييم وظائف الجسيم المركزي الخاصة بهم. في هذه الدراسة قمنا بتطوير فحص باستخدام المناعي غير المباشر (معهد التمويل الدولي) لتحديد المستوى النسبي للبروتين في centrosomes. تم تطوير هذا الفحص بشكل خاص لتحليل الخلايا التي هي من عينات مختلفةوبالتالي لا يمكن تصويرها في نفس الوقت. ويمكن لهذه العينات أن تكون الخلايا التي تم التعامل مع الكواشف المختلفة (أي المخدرات مقابل السيطرة)، التي تم جمعها في نقاط زمنية مختلفة (أي نبض مقابل مطاردة)، أو هي في مراحل مختلفة من دورة الخلية. مبدأ هذا الاختبار يكمن في قياس الخلفية تصحيح كثافة الفلورسنت المقابلة لبروتين في منطقة صغيرة وتطبيع تلك القيمة ضد نفسه للبروتين آخر والتي لا تختلف في ظل الظروف التجريبية اختيار المستويات. وقد استخدمت العديد من الدراسات في علم الأحياء الجسيم المركزي مؤخرا مختلف تقنيات المجهر الكمية، في كل الخلايا الحية أو الثابتة، لتحديد وظيفة الجسيم المركزي محددة من البروتينات مرشح 24-27. مماثلة لتلك المقايسات، والتقنية الحالية أيضا يقيس الخلفية تصحيح كثافة مضان من البروتين الاختبار. ومع ذلك، فإن إدراج تطبيع باستخدام معيار الداخلي في هذا الاختبار من المرجح تقديم أكبردقة وثقة في تحليل عينتين المختلفة التي هي على اثنين من coverslips مختلفة. وعلاوة على ذلك، بالإضافة إلى فحص مستوى البروتين في centrosomes، مع تعديلات طفيفة هذه الطريقة يمكن تطبيقها على مجموعة متنوعة من الظروف التجريبية أو في مواقع الخلوية الأخرى. هنا، ونحن لدينا الجمع بين الكمي المجهري الفحص مع استراتيجية نبض مطاردة BrdU لمقارنة الخلايا من مختلف مراحل دورة الخلية. بدلا من استخدام التقنيات القياسية اعتقال دورة الخلية وإطلاق لدراسة مختلف نقاط زمنية دورة الخلية، وخلايا المتزايد بشكل غير متزامن يتم تحضين مع BrdU لتسمية الخلايا في S-المرحلة، ومطاردة الخلايا المسمى لأوقات مختلفة (عادة 4-6 ساعة). ومعظم الخلايا المسمى يكون في S-المرحلة مباشرة بعد النبض. يتم اختيار طول مطاردة وذلك بعد مطاردة، الخلايا المسمى سيكون في أواخر S، G2، أو الانقسام، والتي يمكن التحقق منها من قبل الخصائص المورفولوجية مثل هذا الموقف الفلك من centrosomes فيما يتعلق مجلس التوحيد الوطنىليو، وبعد المسافة بين centrosomes، والتكثيف من الكروموسومات الخ وهكذا، وطول مطاردة يعتمد على متوسط ​​مدة S، M G2 ومرحلة من نوع خلية معينة. منذ هذا النهج يتجنب مثبطات دورة الخلية مثل هيدروكسي يوريا، aphidicolin، نوكودازول، وما إلى ذلك، يتيح تحليل دورة الخلية أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية. وبالتالي، علينا أن نظهر هنا أن الكمية الفحص المجهري مضان وحدها، أو بالاشتراك مع BrdU نبض مطاردة الفحص، هي تقنية بسيطة لكنها قوية لقياس بدقة التغيرات النسبية في مستوى centrosomal من بروتين مرشح خلال دورة الخلية رابط الجأش. قمنا بقياس مستوى centrosomal من VDAC3، وهو البروتين الذي حددنا مؤخرا في centrosomes بالإضافة إلى الميتوكوندريا 16،28، وذلك باستخدام هذه المقايسات. النتائج التي تم الحصول عليها هنا تحقق من ملاحظتنا السابقة أن تجمع centrosomal من VDAC3 ينظمه تدهور، وتختلف أيضا في dependen دورة الخليةر بطريقة 16 والتأكد من صحتها وعلاوة على ذلك إمكانية تطبيق هذا الأسلوب.

<table><tbody><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F8141</td><td>Stock of 1 mg/ml in water</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>MG115</td><td>Sigma</td><td>SCP0005</td><td>Stock of 10 mM in DMSO</td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td>Stock of 10 mM in DMSO</td></tr><tr><td>Anti-&amp;#947;-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88)</td><td>Sigma</td><td>T 6557</td><td>1:200 in IIF blocking buffer&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal)&amp;nbsp;</td><td>Aviva Systems Biology</td><td>ARP35180-P050</td><td>1:50 in IIF blocking buffer, 1:1,000 in WB blocking buffer</td></tr><tr><td>Anti-Sas6 (mouse monoclonal)&amp;nbsp;</td><td>Santa cruz biotechnology</td><td>sc-81431</td><td>1:100 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Anti-Cep135 (rabbit polyclonal)</td><td>Abcam</td><td>ab-75005</td><td>1:500 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Anti-BrdU (rat monoclonal)&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>1:250 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L)</td><td>Life technologies</td><td>A21093</td><td>1:200 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21202</td><td>1:1,000 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21203</td><td>1:1,000 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21206</td><td>1:1,000 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21207</td><td>1:1,000 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Anti-&amp;#947;-tubulin (rabbit polyclonal)</td><td>Sigma</td><td>T5192</td><td>1:1,000 in WB blocking buffer</td></tr><tr><td>Anti-&amp;#945;-tubulin (mouse monoclonal, DM1A)</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>1:20,000 in WB blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Life technologies</td><td>A10043</td><td>1:10,000 in WB blocking buffer</td></tr><tr><td>Mouse IgG (H&amp;amp;L) Antibody IRDye800CW Conjugated</td><td>Rockland antibodies</td><td>610-731-002</td><td>1:10,000 in WB blocking buffer</td></tr><tr><td>SlowFade Gold Antifade Reagent&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>S36936</td><td>Mounting media</td></tr><tr><td>Round coverslips 12CIR.-1</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX-81 microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Retiga ExiFAST 1394 IR camera</td><td>QImaging&amp;nbsp;</td><td>32-0082B-238</td><td></td></tr><tr><td>100X Plan Apo oil immersion objective</td><td>Olympus</td><td></td><td>1.4 numerical aperture</td></tr><tr><td>Slidebook software package</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odyssey IR Imaging System</td><td>Li-cor Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bicinchoninic acid (BCA) assay</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>U-MNU2 Narrow UV cube</td><td>Olympus</td><td>U-M622</td><td>Filter</td></tr><tr><td>U-MNU2 Narrow Blue cube</td><td>Olympus</td><td>U-M643</td><td>Filter</td></tr><tr><td>U-MNU2 Narrow Green cube</td><td>Olympus</td><td>U-M663</td><td>Filter</td></tr></tbody></table>

quantitative immunofluorescence assay to measure the variation in protein levels at centrosomes

Centrosomes هي عضيات صغيرة ولكنها مهمة التي تشكل أقطاب الإنقسامية المغزل للحفاظ على سلامة الجينوم أو التجمع أهداب الأساسي لتسهيل مهام الحسية في الخلايا. يجوز تنظيم مستوى بروتين مختلف في centrosomes من في مواقع .cellular أخرى، والاختلاف في مستوى centrosomal من عدة بروتينات في نقاط مختلفة من دورة الخلية ويبدو أن تكون حاسمة لتنظيم السليم التجمع مريكز. قمنا بتطوير مضان الكمي المجهري الفحص الذي يقيس التغيرات النسبية في مستوى البروتين في centrosomes في الخلايا الثابتة من عينات مختلفة، مثل في مراحل مختلفة من دورة الخلية أو بعد العلاج مع مختلف الكواشف. مبدأ هذا الاختبار يكمن في قياس الخلفية تصحيح كثافة الفلورسنت المقابلة لبروتين في منطقة صغيرة، وتطبيع أن قياس ضد نفسه للبروتين آخر لا تختلف تحت ج التجريبية المختارةondition. استخدام هذا الاختبار في تركيبة مع نبض BrdU واستراتيجية مطاردة لدراسة دورات خلية رابط الجأش، لدينا التحقق من صحة كميا الملاحظة الأخيرة في أن ينظم التجمع centrosomal من VDAC3 في centrosomes خلال دورة الخلية، من المحتمل بسبب تدهور بوساطة proteasome وتحديدا في centrosomes.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes at JoVE.com

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

الكمية المناعي الفحص لقياس التفاوت في مستويات البروتين في Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

quantitative-immunofluorescence-assay-to-measure-variation-protein

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

15.0K Views.  The Ohio State University. Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein’s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard. 

Video: Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and organogenesis, as well as in multiple diseases. Numerous publications have convincingly shown that specific mechanisms tightly regulate mRNA translation. Increased interest in the translation-induced regulation of protein expression has led to the development of novel methods to study and follow de novo protein synthesis in cellulo. However, most of these methods are complex, making them costly and often limiting the number of mRNA targets that can be studied. This manuscript proposes a method that requires only basic reagents and a confocal fluorescence imaging system to measure and visualize the changes in mRNA translation that occur in any cell line under various conditions. This method was recently used to show localized translation in the subcellular structures of adherent cells over a short period of time, thus offering the possibility of visualizing de novo translation for a short period during a variety of biological processes or of validating changes in translational activity in response to specific stimuli.

This manuscript describes a method to visualize and quantify localized translation events in subcellular compartments. The approach proposed in this manuscript requires a basic confocal imaging system and reagents and is rapid and cost-effective.

الفلورة الكمية لقياس عالمية مترجمة ترجمة

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Biochemistry

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

تحليل الطيفي تقلب Fluorescence من تفاعلات البروتين البروتين في الخلية جهات الاتصال

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

تدفق تحليل Cytometric من التكملة الإسفار ثنائي الجزيء: عالية الإنتاجية الأسلوب الكمي لدراسة التفاعل البروتين البروتين

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the CSF protein composition delivers crucial information in basic neuroscience research as well as neurological diseases. One caveat is that proteins measured in CSF may derive from both intrathecal synthesis and transudation from serum, and protein analysis of CSF can only determine the sum of these two components. To discriminate between protein transudation from the blood and intrathecally produced proteins in animal models as well as in humans, CSF protein profiling measurements using conventional protein analysis tools must include the calculation of the albumin CSF/serum quotient (Qalbumin), a marker of the integrity of the blood-brain interface (BBI), and the protein index (Qprotein/Qalbumin), an estimate of intrathecal protein synthesis. This protocol illustrates the entire procedure, from CSF and blood collection to quotients and indices calculations, for the quantitative measurement of intrathecal protein synthesis and BBI impairment in mouse models of neurological disorders.

Elevated spinal fluid protein levels can either be the result of diffusion of plasma protein across an altered blood-brain barrier or intrathecal synthesis. An optimized testing protocol is presented in this article that helps to discriminate both cases and provides quantitative measurements of intrathecally synthesized proteins.

القياس الكمي للبروتينات التركيبية داخل الفئران

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the ...

Neuroscience

Imaging Centrosomes in Fly Testes

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell differentiation. Centrosomes are essential to determine the cell division axis during mitosis and to nucleate cilia during interphase. The identity of the proteins that mediate these dynamic changes remains only partially known, and the function of many of the proteins that have been implicated in these processes is still rudimentary. Recent work has shown that Drosophila spermatogenesis provides a powerful system to identify new proteins critical for centrosome function and formation as well as to gain insight into the particular function of known players in centrosome-related processes. Drosophila is an established genetic model organism where mutants in centrosomal genes can be readily obtained and easily analyzed. Furthermore, recent advances in the sensitivity and resolution of light microscopy and the development of robust genetically tagged centrosomal markers have transformed the ability to use Drosophila testes as a simple and accessible model system to study centrosomes. This paper describes the use of genetically-tagged centrosomal markers to perform genetic screens for new centrosomal mutants and to gain insight into the specific function of newly identified genes.

Imaging of centrosomal proteins during Drosophila spermatogenesis is a powerful method to identify new proteins critical for centrosome biology as well as to elucidate the particular function of known players in this process.

Centrosomes التصوير في يطير الخصية

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly dependent on modes of single-cell analysis. Methods which deliver composite data reflecting the mean values of biomarkers from cell populations risk losing subpopulation dynamics that reflect the heterogeneity of the studied biological system. In keeping with this, traditional approaches are being replaced by, or supported with, more sophisticated forms of cellular assay developed to allow assessment by high-content microscopy. These assays potentially generate large numbers of images of fluorescent biomarkers, which enabled by accompanying proprietary software packages, allows for multi-parametric measurements per cell. However, the relatively high capital costs and overspecialization of many of these devices have prevented their accessibility to many investigators.
Described here is a universally applicable workflow for the quantification of multiple fluorescent marker intensities from specific subcellular regions of individual cells suitable for use with images from most fluorescent microscopes. Key to this workflow is the implementation of the freely available Cell Profiler software1&#160;to distinguish individual cells in these images, segment them into defined subcellular regions and deliver fluorescence marker intensity values specific to these regions. The extraction of individual cell intensity values from image data is the central purpose of this workflow and will be illustrated with the analysis of control data from a siRNA screen for G1 checkpoint regulators in adherent human cells. However, the workflow presented here can be applied to analysis of data from other means of cell perturbation (e.g., compound screens) and other forms of fluorescence based cellular markers and thus should be useful for a wide range of laboratories.

Presented is a flexible informatics workflow enabling multiplexed image-based analysis of fluorescently labeled cells. The workflow quantifies nuclear and cytoplasmic markers and computes marker translocation between these compartments. Procedures are provided for perturbation of cells using siRNA and reliable methodology for marker detection by indirect immunofluorescence in 96-well formats.

سير العمل عالية المحتوى، الكمي خلية فردية من نيون علامات من المجاهر البيانات العالمي، بدعم من برمجيات المصدر المفتوح

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins within complex biological samples. Since then, western blotting methodology has become a common component of the molecular biologists experimental repertoire. A cursory search of PubMed using the term &#8220;western blot&#8221; suggests that in excess of two hundred and twenty thousand published manuscripts have made use of this technique by the year 2014. Importantly, the last ten years have seen technical imaging advances coupled with the development of sensitive fluorescent labels which have improved sensitivity and yielded even greater ranges of linear detection. The result is a now truly Quantifiable Fluorescence based Western Blot (QFWB) that allows biologists to carry out comparative expression analysis with greater sensitivity and accuracy than ever before. Many &#8220;optimized&#8221; western blotting methodologies exist and are utilized in different laboratories. These often prove difficult to implement due to the requirement of subtle but undocumented procedural amendments. This protocol provides a comprehensive description of an established and robust QFWB method, complete with troubleshooting strategies.

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

دليل لمودرن الكمية نيون الغربية التنشيف مع استراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

البروتينات التحليل المناعي من الداخلية والخارجية السنترومير-الحيز الحركي

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell motility, or cell signaling. The green algae Chlamydomonas reinhardtii has proven to be an insightful model in the study of centriole architecture, function, and protein composition. Despite great advances toward understanding centriolar architecture, one of the current challenges is to determine the precise localization of centriolar components within structural regions of the centriole in order to better understand their role in centriole biogenesis. A major limitation lies in the resolution of fluorescence microscopy, which complicates the interpretation of protein localization in this organelle with dimensions close to the diffraction limit. To tackle this question, we are providing a method to purify and image a large number of C. reinhardtii centrioles with different orientations using super-resolution microscopy. This technique allows further processing of data through fluorescent single-particle averaging (Fluo-SPA) owing to the large number of centrioles acquired. Fluo-SPA generates averages of stained C. reinhardtii centrioles in different orientations, thus facilitating the localization of distinct proteins in centriolar sub-regions. Importantly, this method can be applied to image centrioles from other species or other large macromolecular assemblies.

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

We have developed a strategy to purify and image a large number of centrioles in different orientations amenable for super-resolution microscopy and single-particle averaging.

والعزلة وتصوير الأسفار لتعمير واحد-الجسيمات Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An optimal method of quantification is accurate, has a broad linear dynamic range and maintains the structural integrity of the sample to allow for identification of individual cell types. Current methods such as immunohistochemistry (IHC), mass spectrometry, and immunoblotting each fail to meet these stipulations due to their categorical nature or need to homogenize the sample. As an alternative method, we propose the use of immunofluorescence (IF) and image analysis to determine the relative abundance of a protein of interest in FFPE tissues. Herein we demonstrate that this method is easily optimized, yields a wide dynamic range, and is linearly quantifiable as compared to the gold standard of quantitative immunoblotting. Furthermore, this method permits the maintenance of the structural integrity of the sample and allows for the distinction of various cell types, which may be crucial in diagnostic applications. Overall, this is a robust method for the relative quantification of proteins in FFPE samples and can be easily adapted to suit clinical or research needs.

We describe the use of quantitative immunoblotting to validate immunofluorescence histology coupled with image analysis as a means of quantifying a protein of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples. Our results demonstrate the utility of immunofluorescence histology for ascertaining the relative quantity of biomarker proteins in routine biopsy samples.

إيمونوبلوتينج كمية من خطوط الخلايا كمعيار للتحقق من صحة الفلورة للتحديد الكمي للعلامات البيولوجية البروتينات في عينات الأنسجة الروتينية

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An ...